2013 Fiscal Year Research-status Report
GlucolipotoxicityにおけるPKCδ依存性β細胞死
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25461366
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
藤本 啓 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (40372974)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | apoptosis / beta cell mass / pkcdelta / pdx1 |
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| Research Abstract |
糖尿病は、膵β細胞死による膵β細胞容積の減少が発症の一因だと考えられている。膵β細胞死にはアポトーシスが関与するという報告は多いが、ミトコンドリア依存性壊死とオートファジーも関与することが報告された。また、遊離脂肪酸(FFA)は高ブドウ糖環境下において小胞体ストレスを惹起することで、マウスインスリノーマ細胞株（MIN6細胞）や膵島に対して毒性を示すことが知られている (糖脂肪毒性)。膵β細胞増殖や細胞死に関与するProtein Kinase C (PKC) δはジアシルグリセロール(DAG)によって活性化され、DAGはFFAにより増強される。PKCδの欠失は高脂肪食による耐糖能や脂肪毒性による細胞死を抑制することが報告されており、膵β細胞容積変化への影響が示唆される。そこで本研究では、糖脂肪毒性による膵β細胞におけるPKCδ依存性膵の膵β細胞死について検討する。レンチウイルスベクターを用いてMIN6細胞のPKCδをノックダウンし、さらに、糖尿病モデルマウスのPKCδを膵β細胞特異的に欠失することで、膵β細胞死の分子機序を細胞および個体レベルで証明する。
MIN6細胞を用いた検討により、糖脂肪毒性条件下では膵細胞の発生・維持に不可欠なpancreatic and duodenal hemeobox1(Pdx1)の発現がmRNA発現量・蛋白量共に低下した。PKCδはmRNA発現量・蛋白量共に変化は認められなかったが、糖脂肪毒性条件下でPKCδのリン酸化の亢進が認められた。PI/DAPI染色比は糖脂肪毒性条件で有意に細胞死の増加を認めた。さらに、レンチウイルスベクターを用いてPKCδをノックダウンしたところ、糖脂肪毒性条件下におけるPdx1の低下はmRNA発現量・蛋白量共に有意に抑制された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitroにおける糖脂肪毒性による膵β細胞死のPKCδの関与が示唆された。今後は細胞死の様式をさらに詳細に検討予定である。
一方、in vivoにおける膵β細胞死のPKCδの関与には、膵β細胞特異的PKCδの欠失が必要不可欠である。しかしながらCre-LoxPシステムを用いたマウスの作成に少なくとも３世代以上の交配が必要である。さらにメスマウスは性周期による血糖変動が大きいことよりオスマウスのみを使用する予定のため、数を確保するために日数を要するため本実験はまだできず、交配を進めている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
＜in vitro＞
平成25年度の研究において、糖脂肪毒性によるPdx1の減少と細胞死の増加が起きることが確認された。また、PKCδのノックダウンを行うことでPdx1のmRNAの減少が抑制されることがわかった。次年度以降はノックダウン時におけるWestern blotの検討を行う。 PKCδの発現調節については、specific inhibitorであるRottlerin、PKC pan inhibitorのBisindolymaleimide Iを用いて同様の検討を行い、PKCδと細胞死の関連を更に検討していく。また、PKCδが切断されたCFは核移行シグナルにより核への移行することが知られており、PKCδの局在評価を行うほか、PKCδのリン酸化活性をWestern blotで検討する。
＜in vivo＞
引き続き膵細胞特異的PKCδノックアウトマウスを樹立する。樹立後、2型糖尿病モデルマウスとして新生児期ストレプトゾトシン(neonatal STZ model)投与モデルを作製して検討する。このモデルはSTZ投与時に膵細胞再生能が保持されており、一旦膵細胞容積が改善後、緩やかに膵β細胞容積が減少し耐糖能が悪化すると考えられている。このモデルは自然経過で8～10週頃に血糖上昇が予想され、その時点から高脂肪食(45%kcal fat diet)を摂取させ、耐糖能及び膵細胞容積変化を検討していく。対照群はRIP2-creマウスに野生型マウスを交配させたマウスを用い、STZ投与の有無で比較を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度へ繰越が必要な実験があるため
実験用研究試薬の購入
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