新規中性脂肪吸収抑制薬であるSAR1B抑制PIポリアミドの開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461378
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 上野 高浩 日本大学, 医学部, 准教授 (40386008)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: PIポリアミド / Sar1b

Outline of Annual Research Achievements

初年度にデザイン合成し、ターゲット配列への結合が確認できた2種のヒトSar1bに対するPIポリアミドをヒト小腸上皮細胞Cell lineであるCaCo2細胞に1μMで添加しSar1b mRNA抑制効果を検討した。作成した2種類のポリアミドはともに有意にSar1b mRNAを抑制した。さらに、CaCo2細胞を継続培養して小腸上皮様に分化させ、PI ポリアミドの脂質合成への影響を評価したところ、PIポリアミドはCaCo2細胞の脂質合成を抑制させた。
さらにPIポリアミドの効果をin vivoで評価するために、ラットSar1bを抑制するPIポリアミドの作成を行った。ラットSar1bプロモーター配列をTransfacデータベースにて解析し、そのプロモーター領域に2カ所のSRE配列を同定した。その下流SREに結合する2種類のラットPIポリアミドをデザイン、合成し、ゲルシフトアッセイにてそのターゲット配列への結合を確認した。次いで、ラット小腸上皮細胞であるICE-6を用い、2種のPIポリアミドのSar1b ｍRNA抑制効果を検討した。反復して検討を行ったが、2種のPIポリアミドともにSar1b抑制効果は確認できなかった。そのため、上流SREをターゲットとしたPIポリアミドをさらに2種類デザイン合成し、そのターゲットへの結合をゲルシフトアッセイで確認した。この2種のPIポリアミドのうちの1種でICE-6細胞のSar1b mRNA発現を有意に抑制することを確認できた。
ラットin vivoでの研究を目指し、PIポリアミドの小腸への取り込みを検討した。培養液中に10μMでFITCでラベルしたPIポリアミドを添加し切除したラット小腸をオーバーナイトで静置し、翌日に凍結切片を作成して取り込みを検討したが、明らかな取り込みは確認できなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度にSar1bPIポリアミドの効果を評価する培養細胞系の確立に時間を要したために、全体として進行がやや遅れている。それに加え、最初に2種類ラットPIポリアミドをデザイン、合成したものが、培養細胞系で効果が得られず、さらに反復して評価を行った。それでも効果が確認できず、やむを得ず別のプロモーター領域に結合するPIポリアミドを再度合成して評価を行った。最終的には有効なラットPIポリアミドを得ることができたが、多くの時間を必要としたためにさらなる遅れの原因となっている。

Strategy for Future Research Activity

ラットPIポリアミドが確立されたので、今後はまず、PIポリアミド投与経路の検討に入る。PIポリアミドはこれまで静注での有効性が示されているが、経口投与にて小腸上皮細胞へ取り込ませることを目指して検証を重ねていく。具体的にはFITCラベルしたPIポリアミドを塩酸で処理した後に電気泳動、HPLCで評価し、胃酸に対する安定性を確認する。さらに、FITCポリアミドをラットに経口投与して後に小腸を切除して凍結切片を作成して検鏡し、小腸細胞への取り込みを確認する。小腸細胞への取り込みが確認されれば経口で投与し、確認できなければ静注にて投与して小腸Sar1b mRNAに対する効果、血清脂質に対する効果を評価する。

ヒトのPIポリアミドについてはCaCo2細胞を用いた検討を続ける。CaCo2細胞を小腸上皮細胞様に分化させ、そこにPIポリアミドを添加し、リポ蛋白合成に対するPIポリアミドの効果を評価する。評価は培養液に分泌されたリポ蛋白をゲル濾過HPLC法にて分析して行う。