骨髄腫SP細胞で特異的に異常発現するmicroRNAの同定

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461406
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 亀岡 吉弘 秋田大学, 医学部, 講師 (40422159)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田川 博之 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30373492)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 多発性骨髄腫 / microRNA / side population

Research Abstract

臨床検体:20検体と骨髄腫14細胞株のSPと非SP細胞(MP)を純化し網羅的なmiRNA/遺伝子発現解析を行い、SPと非SP(以下MP)での発現比較を行う。遺伝子発現解析のプラットフォームは CodeLinkTM Bioarray (Applied Microarrays, Inc.)を用いる。microRNAの解析にはmiRCURY LNATM microRNA array 6th generation (Exiqon, Inc.)を用いる。Array scanner はGenePic 4000B (Molecular Devices)を、解析ソフトはArray-Pro Analyzer Version 4.5(Media Cybernetics, Inc.)を使用する。骨髄腫臨床検体では、CD138で標識した細胞からSP細胞を純化し、RNAを抽出し、遺伝子網羅的発現解析を行った。その際の遺伝子発現の比較はCD138陽性のSPとMP細胞分画である。現在解析中であるがSPとMPは、明らかに性質が異なることからmiRNAおよび遺伝子発現差があると考えられる

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

網羅的遺伝子解析がすでになされており、現在解析中である。

Strategy for Future Research Activity

同定されたmiRNAに対する機能解析を中心に行う。例えば前ページ図のmiR-181の標的蛋白としてBmi-1が考えられる(RPMI 8226細胞株では、EZH2発現上昇→miR-181発現低下→Bmi-1発現上昇→Pten or Bim発現低下→Bcl2発現上昇という機序を明らかにしている)。
1) 標的となりうる遺伝子のsiRNAや miRNAを設計しtetracycline off systemにより発現調整ができるvectorを細胞株に導入する。そしてNOGマウス(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnul mouse)に、標的遺伝子のsiRNA/miRNAレトロまたはレンチウィルスベクターを組み込んだ腫瘍細胞株または臨床検体細胞を経皮下的に移植して腫瘍を発症させた後、tetracycline(5g/l)水を同マウスに投与してsiRNA/miRNAを発現させ、SP細胞への腫瘍抑制効果を検討する。効果が認められた場合、それはmiRNAの本質的な標的蛋白である。
2) Luciferase assayによりmiRNAの標的蛋白を直接コードするmRNAを同定する。
3) 骨髄腫進展に伴うSPにおけるmiRNAの検索を行う。つまり、MGUS(monoclonal gammopathy undetermined significance), 無症候性骨髄腫、症候性骨髄腫、そして、再発難治性骨髄腫といった病態の進行に伴うmiRNAのSPにおける発現変化を網羅的解析で探索する。
4) 遺伝子発現解析でSP特異的に発現する細胞表面抗原が判明すれば、抗体を作成し生体内での骨髄幹細胞の同定をも目指す。