2013 Fiscal Year Research-status Report
LPXNのサイトカイン反応性シグナルとETV6-LPXNにおける過剰反応性の解析
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25461437
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
安部 明弘 藤田保健衛生大学, 医学部, 客員准教授 (00432261)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
恵美 宣彦 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (30185144)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ETV6 / LPXN / G-CSF / NUP98 / HOXA9 / サイトカイン |
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| Research Abstract |
ETV6-LPXNはNUP98-HOXA9を有する急性骨髄性白血病の経過中に付加的に生じた融合遺伝子で、白血病の悪化に関与したと推察される。LPXNはパキシリンファミリーに属し、外部からのシグナルを細胞内で伝達するアダプター分子である。
LPXN、ETV6-LPXNおよびETV6のPNT領域を欠失したΔETV6-LPXNをマウスIL-3依存性白血病細胞株32Dに導入した32D/ LPXN,32D/ETV6-LPXN,32D/ΔETV6-LPXNとベクターのみを導入した32D/mockを作製し、サイトカイン反応性増殖とG－CSFによる顆粒球分化への影響について解析した。どの細胞も、IL-3非存在下では増殖を維持できなかった。そこで、低濃度のIL-3存在下での各種サイトカインによる増殖効果を調べたところ、G-CSFで32D/ETV6-LPXNに最も強い増殖が認められた。このことから、ETV6-LPXNはG-CSFに対する過剰反応性を生じている可能性が考えられた。
G-CSFによる顆粒球への分化を、Gr-1発現の変化と形態変化で解析した。32DはG-CSFにより顆粒球へ分化しGr-1の発現が増加するが、分化細胞の割合は、32D/ETV6-LPXNにおいて増加した。ETV6-LPXNでは、Gr-1陽性細胞は増加するものの、２週間目以降は逆に生細胞は減少した。G-CSFの作用による細胞増殖と分化が促進された結果、早期に細胞の死滅が生じたものと考えられる。ETV6-LPXNは顆粒球への分化阻害なくG-CSFに対する過剰反応を引き起こすと考えられた。
細胞内での局在を調べると、LPXNとΔETV6-LPXNは細胞質を中心に均一な局在を示すのに対し、ETV6-LPXNは細胞質に数個のスポットとして局在が認められ、ETV6を介した多量体化により局在が変化していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LPXN、ETV6-LPXN、ΔETV6-LPXNをクローニング後、レトロウイルスベクターに組み込み、細胞へ遺伝子導入しその性質を細胞増殖と分化を中心に研究を行った。また、GFPとの融合遺伝子による細胞内局在の解析では、ETV6-LPXNにおいて大きな変化が認められた。ETV6-LPXNではG-CSFによる細胞増殖が刺激されるが、分化は阻害しないため細胞の増加は一時的であった。ETV6-LPXNでは、サイトカイン非依存性の増殖は示さず、IL-3以外のサイトカインでは増殖維持ができなかったため、低濃度のIL-3存在下に様々なサイトカイン反応性の解析が必要となり苦労を要した。予定した遺伝子コンストラクト, 遺伝子導入細胞は予定通り作製され解析が進められている。研究はおおむね予定した通りに進んでいるが、LPXNは市販のリン酸化抗体がないことから、活性状態を調べることが容易ではなくシグナルの解析に困難を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ETV6-LPXN単独では、G-CSFに対し強い増殖を生じるが分化阻害は示さないことから、急性骨髄性白血病への関与に関しては他の白血病関連遺伝子との協調作用による白血病への関与を調べる必要がある。この症例では、NUP98-HOXA9が併存したことから、この遺伝子との協調作用についての解析を進めている。
ETV6-LPXNのシグナルに関しては、LPXNのTyr72に対するリン酸化抗体を外部機関に作製依頼しており、作製までに数ヶ月を要したが近日中に納入される予定である。入手次第その性能を解析する計画を立てているが、効率の良いリン酸化抗体できれば、ETV6-LPXNの活性化状態の解析が容易になり研究の進展が期待される。
また、ETV6－LPXNによる遺伝子発現の変化を、次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子解析により分析し、ETV6-LPXNの下流で働く遺伝子を同定する研究を予定している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
LPXN遺伝子に対するリン酸化抗体を外部機関へ委託作製依頼をしているが、作製までに数ヶ月を要しており納品が費用収支集計までに間に合わなかった。このためそれに伴う関連抗体、タンパク質解析用の試薬購入計画にも遅れが生じた。また、次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子解析を予定しているが機器の使用可能時期との関連で試薬購入のための支出が遅れている。
外部機関へ委託作製依頼した抗体は近日中に納付され、タンパク質解析用の試薬も合わせて購入を予定している。また、次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子解析用の試薬購入を計画しており、繰り越し金は全額支出される予定である。
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[Journal Article] Injectable Bone Tissue Engineering Using Live Mesenchymal Stem Cells.2013
Author(s)
Yamada Y, Nakamura S, Ito K, Umemura E, Hara K, Nagasaka T, Abe A, Baba S, Furuichi Y, Izumi Y, Klein OD, Wakabayashi T.
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Journal Title
Stem Cells
Volume: 31
Pages: 572-580
DOI
Peer Reviewed
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