2013 Fiscal Year Research-status Report
血友病Ａに対する有効な遺伝子治療法の開発を目指した基礎的検討
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25461460
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
水上 浩明 自治医科大学, 医学部, 准教授 (20311938)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 遺伝子治療 / 血友病 / ベクター / AAV |
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| Research Abstract |
血友病Aの遺伝子治療に向けた基礎的検討として，凝固第VIII因子の遺伝子を単一のベクターに搭載する方法に重点を置いて検討した．凝固第VIII因子の遺伝子は全長で約9kbあることから，そのままではAAVベクターに搭載することはできない．解決法としては重鎖と軽鎖を別々のベクターに搭載し，両者を共感染させて発現を期待する方法と，Bドメインを除いたいわゆるBDDタイプの遺伝子(4.4kb)を用いて単一のベクターで遺伝子導入を用いる方法の２つが考えられる．先ずは単一のベクターで効果を検討することとし，これに組み合わせるプロモーターの探索を行った．今回はAAV8を元にしたベクターを用いて肝臓への遺伝子導入を目指すアプローチであることから，肝臓における効果が期待できるプロモーターを用いることが望ましい．比較検討したところ，BDD型の遺伝子に肝臓特異的なプロモーターを適宜短縮して組み合わせたベクターが好適と考えられ，in vitro の検討でも凝固第VIII因子の活性が得られた．AAVベクターの作製効率に関しては，ベクター長との関連が大まかに知られており，野生型に相当する4.7kbを超えた場合，作製効率が低下する傾向があることが知られている．但し，その程度や血清型による違いなどは充分明らかにされていない．今回検討した中では5.0kbのベクター長を持つものが最良と考えられたが，その作製効率は野生型相当の長さを持つものに比べてやや低下するものの，実際に使用する量を準備可能であることが判明した．従ってこの構築を持つ８型のベクターを多めに調製し，in vivoを含むその後の検討に向けた準備を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画と照らし合わせてみると，予定を上回るペースで進んでいる部分と遅れている部分が存在するが，総合的には概ね目標は達成できたと考えている．本研究の最終目的は血友病Aに対する遺伝子治療の実施になるが，そこに至るまでにはさまざまな技術的課題があるものと思われる．幸い初年度において凝固第VIII因子を用いたベクターを構築し，発現を確認することができた．この点は本研究の基礎をなすものであり，重要な拠点といえる．このためには様々な測定系を含む研究インフラの整備が必要であり，このような準備を終えることができたことから，今後は探索するべき条件の検討に集中することが可能となった．一方で，ベクター長と作製効率の関係に関してはまだ探索を行う余地が残されており，今後類似した長さのベクター作製に際して，血清型による違いも含め，検討していく必要がある．また，２つのベクターを用いる方法に関しても計画に比べて検討が進んでいない．これは単一のベクターを用いる方法で一定の効果が認められたために，この方法による検討を優先した結果であり，やむを得ないものと思われるが，今後単一のベクターでは充分な結果が得られないとする結論が得られた場合には再度条件検討に戻る必要があり，時間的な制約を生じる元となる．幸い血友病Bに対する遺伝子治療は既に臨床研究が進められており，肝臓を標的とすること，そのために現有のベクターでは８型が最も有効と考えられること，ベクターの必要量が概ね判明していることなどが先行例として参考となることから，これらの情報を上手に活用して研究遂行上の無駄を少なくしていきたい．
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| Strategy for Future Research Activity |
今回多めに調製したベクターを用いてin vivoにおける効果を検討する．その結果により今後の方向付けが異なる可能性が高い．すなわち期待している効果が得られれば，現在中心的課題として行っている単一のベクターを用いる方法をさらに発展させることを目指す．このためにはサルにおける検討も含めてヒトに対する臨床研究に近づくための検討を進めていくことになる．もちろんそのまま臨床応用まで一気に進むとは考えにくいことから，ベクターの改良を含めて様々なオプションを用意しながら進めていくことになる．発現のレベルが期待に達していない場合には，発現を高めるための方策をさまざまに講ずることになる．すなわち，より高い発現を得るためのプロモーターに関する再探索，ベクター長と作製効率に関するデータなどを地道に重ねていくことになる．26年度の前半をこのような基礎的検討に宛て，さまざまな工夫によっても充分な効果が得られなかった場合には，もう１つのアプローチである凝固第VIII因子遺伝子を２つのベクターに分けて遺伝子導入を行う方法に関して探索を進めていく予定である．なお，今回の計画を立案した後の進歩として，ヒト肝臓に対して８型以上に効果の見られるベクター開発の試みが報告され (Nature 506:382-6,2014)，ヒトの肝臓への遺伝子導入に一層適したベクターを新たに開発しようとする気運が高まっている．このような進歩を取り込むことでより効果の高い治療法の開発に繋がる可能性があることから，今後の検討に際して留意していく予定である．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
想定していたよりも円滑に in vitro の実験が進み，物品の使用量が少なくて済んだため．
今後の in vitro 及び in vivo の実験において幅広い探索を行う事とする．
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[Journal Article] Prevalence of neutralizing antibodies against adeno-associated virus capsids is reduced in young Japanese individuals.2014
Author(s)
Mimuro, J., Mizukami, H., Shima, M., Matsushita, T., Taki, M., Muto, S., Higasa, S., Sakai, M., Ohmori, T., Madoiwa, S., Ozawa, K., Sakata, Y.
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Journal Title
Journal of Medical Virology
Volume: 86
Pages: 1990-7
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Accurate measurement of NAb status against AAV vector capsids and an approach toward managing its inhibitory effect2013
Author(s)
Mizukami H, Mimuro J, Hishikawa S, Ikemoto T, Uchibori R, Tsukahara T, Urabe M, Kume A, Sakata A, Ohmori T, Madoiwa S, Sakata Y, Ozawa K
Organizer
21st Annual Congress European Society for Gene and Cell Therapy
Place of Presentation
Madrid, Spain
Year and Date
20131025-20131028
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[Presentation] Precise evaluation of NAb against AAV vectors and approaches toward managing its inhibitory effect2013
Author(s)
Mizukami H, Mimuro J, Uchibori R, Tsukahara T, Urabe M, Kume A, Sakata A, Ohmori T, Madoiwa S, Sakata Y, Ozawa K
Organizer
第75回日本血液学会学術集会
Place of Presentation
札幌
Year and Date
20131011-20131013
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