2013 Fiscal Year Research-status Report
血小板とフォンウィルブランド因子の相互作用を中心とした血栓形成の制御
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25461463
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
松井 太衛 藤田保健衛生大学, 医療科学部, 教授 (90183946)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | フォン・ビルブランド因子 / 血小板 / ヘビ毒タンパク質 / 組換えタンパク質 |
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| Research Abstract |
1) ボトロセチン2のVWF及びGPIb結合必須部位の特定
cDNAを用いて組換えボトロセチン(rBot2)を発現させ、Ala置換変異導入ボトロセチンの、固相化したVWFとGPIbに対する結合能をDot-blot法やELISA法を用いて解析した。これまでの先行研究で、α鎖のGluα107、β鎖のAspβ70、Aspβ88、Argβ115、Lysβ117などのアミノ酸残基をAlaに置換した5種類の変異体rBot2は血小板凝集誘起活性が低下することを見出している。これらのうち、Aspβ70、Aspβ88、Gluα107のAla置換変異体でVWFとの結合活性の低下がみられた。またArgβ115、Lysβ117の各変異体ではグリコカリシンとの結合活性が低下していた。一方、GPIbのN末端側に接触すると予想して調製したGluα48、Aspα50、Lysα108、Aspα109、Leuβ59、Lysβ60のAla置換体などは、野生型と同じ血小板凝集惹起活性を示した。これらの結果から、rBot2を構成するアミノ酸残基のうち、Aspβ70、Aspβ88、Gluα107はVWFとの結合に、Argβ115、Lysβ117はGPIbとの結合に関与するものと推定された。
2)抗血栓性ドミナントネガティブ・ボトロセチンの作製
Argβ115、Lysβ117の変異体がVWFとの結合能はそのままに、GPIbとの結合能が低下していたことから、さらにこれらの塩基性残基を酸性アミノ酸に置換することでより強い反発が観察されることを期待して、逆荷電のGluに置換した変異体を作製した。このダブル変異体はVWFとの結合能は変化しなかったが、血小板凝集惹起活性は示さず、さらにリストセチンによる血小板凝集を濃度依存的に阻害した。この結果から、VWFに特異的に結合しGPIb依存性血小板凝集を阻害する変異体と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
タンパク質の発現が、培養細胞を用いているため収量が多くなく、多種類の変異体のcDNA設計からプラスミド調製、トランスフェクション、タンパク質の精製を経ての活性測定は非常に時間と労力を必要とする。平成25年度は大学院生の頑張りもあって一定の成果を上げることができたが、今後つめるべき点がいくつかあり追加実験を予定している。年度末に予定してた論文執筆が予想外に学事に時間を取られ遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）新たに見出されたVWF結合性血小板凝集阻害変異タンパク質の、ずり応力惹起血小板凝集に対する影響をコーンプレート型ずり応力測定系を用いて解析する。測定は、奈良医大の松本教授に協力をお願いする。データをまとめ、学会発表、論文作成を目指す。
２）さらに強い阻害活性を持った変異体が得られないかcDNAを改変して発現させ、血小板凝集に対する影響を調べる。
３）ヘビ毒に含まれる血小板膜GPIb結合タンパク質のcDNAを用いてアミノ酸変異体を作成し、GPIbとの相互作用に必須のアミノ酸残基の同定を目指す。cDNAと発現に関する論文を作成する。
４）当研究室で発見し、cDNAクローニングしたビチセチン3に関して、効率的な発現系の開発を目指す。cDNAと発現に関する論文を作成する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初購入を予定していた卓上冷却遠心機をデモしたところ、予想外に小さく効率が悪かったため、さらに３つのメーカーの製品をテストした。この結果、冷却機能を捨てて、機能性、安全性、静寂性、スペース等を考慮して申請とは異なる機種を購入するに至った。冷却機能が附属しないため予定よりも30万円程度安く購入できたことで次年度使用額が生じた。また、消耗品を節約したことにより予算が小さくて済んだ。
分子生物学用試薬、細胞培養用試薬、抗体試薬、プラスチック消耗品類などの購入を行う。プレゼンテーション用に軽量のノートパソコン購入を考え中である。
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