2013 Fiscal Year Research-status Report
チクングンヤウイルス感染受容体及び感染関連細胞性因子の同定
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25461510
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
田中 淳 大阪大学, 微生物病研究所, 特任講師 (20321953)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | シュードタイプウイルス |
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| Research Abstract |
CHIKV感染性評価系として、CHIKV膜蛋白質を持つマウスレトロウイルスシュードタイプを作製しその感染性について検討した。EGFP遺伝子が挿入されたマウスレトロウイルスベクタープラスミド、マウスレトロウイルスgag-pol発現プラスミド、及びCHIKV-膜蛋白質遺伝子発現プラスミドの３種類のプラスミドDNAを293T細胞にコトランスフェクションすることで、CHIKV膜蛋白質を被ったレトロウイルスシュードタイプを作出した。このCHIKV膜蛋白質を被ったシュードタイプウイルスの感染力価は、もっとも感受性の高い培養細胞株において約1,000,000 IU/ml、もっとも感受性の低い細胞株においては20 IU/ml以下であり、標的細胞株間でその感染性に10,000以上の差が観察された。またこれらシュードタイプウイルスの感染は抗CHIKVウサギ血清で中和されCHIKV膜蛋白質を介して成立すると考えられた。
CHIKV感染受容体及び感染関連細胞性因子の同定のため、上記のCHIKVシュードタイプウイルス感染に最も高感受性であった細胞株のmRNAから合成されたcDNAライブラリーが導入されたレトロウイルスベクタープラスミドライブラリーと、レトロウイルスgag-pol発現ベクター、並びに水疱性口内炎ウイルス膜蛋白質遺伝子とを293T細胞株にコトランスフェクトすることで、cDNAライブラリーを発現するレトロウイルスベクターを作出した。これらcDNAライブラリー発現レトロウイルスベクターをCHIKV抵抗性または低感受性であると考えられたT細胞由来の細胞株に感染させ、レトロウイルスベクターの持つ薬剤耐性遺伝子(puromycin)を指標に選抜を行い、cDNA発現細胞ライブラリーを作出した。現在これらの細胞ライブラリーからCHIKV感受性の亢進した細胞の選抜を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CHIKV感染性評価系の確立とCHIKV高感受性細胞株由来cDNA発現細胞ライブラリーの作出までは計画通り順調にできたが、複数の細胞性因子がCHIKV感染を成立させるために必要な場合、現在の系ではCHIKV感染関連細胞性因子の同定が困難になると予想される。CHIKV-膜蛋白質発現シュードタイプウイルス感染以外の方法によるCHIKV感染関連細胞性因子の同定方法の確立が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
複数の細胞性因子がCHIKV感染を成立させるために必要な場合、現在進行中の発現クローニングではCHIKV感染関連細胞性因子の同定が困難になると予想される。今後はCHIKV感受性細胞株で発現している蛋白質を欠損させたノックアウト細胞ライブラリーからCHIKV感染抵抗性細胞の選抜クローニングを行うことで、CHIKV感染関連細胞性因子の同定を試みる。このためのノックアウト細胞ライブラリーの作製及び、CHIKV感染抵抗性細胞の選抜を行うためのCHIKVベクターの構築を検討する。
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