2013 Fiscal Year Research-status Report
網羅的解析による地域におけるノロウイルスの遺伝子変化の把握と病態との関連
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25461530
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Toyama Institute of Health |
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Principal Investigator |
滝澤 剛則 富山県衛生研究所, その他部局等, その他 (40192158)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ノロウイルス / 感染性胃腸炎 / 食中毒 / 環境水 / 次世代シークエンサー / メタゲノム解析 |
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| Research Abstract |
本年度は、遺伝子型による病原性等の違いを検討するために、感染事例（散発、集団発生事例）及び下水流入水から検出されたノロウイルス（NoV）の遺伝子群、型の検出頻度を比較検討した。その結果、遺伝子群II．遺伝子型4（GII.4）が感染事例（散発及び集団）と下水流入水から最も高頻度に検出され、次いでGII.2が同様に検出された。また、GII.13は集団事例からは比較的高頻度に検出されたが、散発事例及び下水流入水からは低頻度にしか検出されなかった。一方、GI.4は下水流入水からは高頻度に検出されたが、感染事例からは集団事例1例のみとほとんど検出されなかった。以上から、NoVには主に顕性感染により広がる遺伝子型、不顕生感染により広がる遺伝子型、局所的な発生に止まる遺伝子型などが存在すると推定された。
次に、次世代シークエンサー（NGS）の解析条件をNoV陽性の便または吐物乳剤を用いて検討した。その際、遺伝子型判定に用いるカプシド5’領域のPCR増幅産物のNGS解析と、PCRによる増幅の偏りを除外するために、便または吐物乳剤から抽出した総RNAを用いたメタゲノム解析を試みた。後者の解析からは約10の5乗リード数が得られた。大半は細菌由来の配列であったが、NoVの配列も0～数千リード存在した。前者からは約10の6乗リードが得られた。それらは約10の2乗の重複配列を含み、NoVも6～11配列存在した。いずれの解析でも、ほとんどの検体から複数種の遺伝子型が検出された。
同一検体から複数種の遺伝子型が検出されたことから、極少数含まれるNoV配列の検出にNGS解析は有効であると考えられたが、NoVの検出リード数が少ないため、各遺伝子型の発症への関与は不明である。今後は、さらに総リード数を増やして解析する必要がある。その際、多数のリードを解析する手法の整備も必要であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
感染事例及び下水流入水から検出されたNoVの遺伝子型の検出頻度を比較検討することにより、NoVの遺伝子型により病原性等に違いがある可能性が認められた。また、NoVの特定領域を対象としたPCR産物からのNGS用ライブラリー作成手法と、検体から抽出した総RNAを用いたメタゲノム解析用のライブラリー作成手法とがほぼ確立できた。解析の結果、同一検体から複数種の遺伝子型が検出されたことから、NGSを用いることにより検体にごく少数含まれる遺伝子型が検出可能であることが判明した。以上から、現在までの達成度をほぼ順当と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
NGSによる解析手法として、平成25年度はライブラリー作成の材料としてPCR産物を用いる方法と、総RNAを用いる方法とを比較したが、PCR増幅産物では解読できる領域が限定されること、また、PCRによる増幅の偏りのないメタゲノム解析の方が、検体に含まれる複数の遺伝子型の割合を反映していると考えられることから、今後はメタゲノム解析を中心に進めていく。その際、NoVの遺伝子型による病原性の違いを検討するには、NoV遺伝子の全長を解析することが望ましいと考えられる。そのため、メタゲノム解析により得られる総リード数をできるだけ多くし、NoV遺伝子の解析リード数も多くする必要がある。本年度は、まずその条件を検討する。
NoVの遺伝子配列を解析するには、総リードからNoV遺伝子配列を抽出し、既知のNoV配列と比較検討する必要があり、そのために高性能の解析用PCおよび解析ソフトの導入が必要となる。NGSの解析を既に行っている細菌部の協力を得て、解析手法を速やかに導入していく。
以上の整備を進めながら、得られたNoV配列の特徴を解析し、感染事例及び下水流入水から検出される遺伝子型間でのNGS解析を比較検討し、病原性等に関わる領域の有無を検討していく。
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Research Products
(1 results)
