2014 Fiscal Year Research-status Report

病因性ミトコンドリアDNA複製遅延によるミトコンドリア関連疾患治療の検討

Research Project

Project/Area Number	25461573
Research Institution	Chiba Cancer Center (Research Institute)
Principal Investigator	越川信子千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 主席研究員 (90260249)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	渡部隆義千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 研究員 (60526060) 永瀬浩喜千葉県がんセンター(研究所), 研究所, 研究所長 (90322073)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	ミトコンドリアDNA / mtDNA異常 / MELAS / cybrid / PIポリアミドFITC修飾
Outline of Annual Research Achievements	前年度、非修飾のPIポリアミド２種類をHeLa細胞にMELAS mtDNA 異常　3243A>Gを導入したHeLamt3243と対照群のHeLamtN44(Normal)に20日間にわたって処理したが、細胞の増殖の遅延等の顕微鏡下での変化は認められなかった。また、十分な量のPIポリアミドを作製するのが困難であった。また、その精製度にも問題があった。しかし、PIポリアミドの合成が軌道にのり、研究できる十分な量のポリアミドの入手が以前より簡便になり、精製度も上がった。本年度は、MELAS mtDNA 異常　3243A>Gを標的としたPIポリアミドにFITC修飾をしたmt3243/FITCを作製することを試みた。その目的は、PIポリアミドがミトコンドリアDNAに局在しているか否かを明らかにするためである。2種類のmt3243に対するPIポリアミド(PIP)の作製と、FITC修飾を試みたが、１種類のPIP-FITC修飾物の合成に成功した。また、本年度から設置された超微形態観察可能なconfocal顕微鏡を用いることにより、ミトコンドリアとPIP-FITCの二重染色観察が可能となった。ミトコンドリア染色にはMitotracker Redを用いた。これらの観察結果から、PIP-FITCは細胞処理後１時間でミトコンドリアに局在する傾向を示した。しかし、３時間後には細胞質の細胞内小器官に移動し、さらに２日後には、核の周囲の細胞内小器官にのみ観察される傾向だった。細胞内小器官のどの部位にPIP-FITCが集積しているかを確認する必要がある。ただしこの観察には、固定に関する問題点があり、PIP-FITCと他の細胞内小器官の固定法が異なるため生細胞での観察が必要であると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 代表者の体調不良と、PIポリアミドの合成が標的とするDNA構成により困難なため、実験に供するだけの十分な量ができないことが問題であった。両問題点が改善の方向に進んだため、最終年度に向けて研究ペースを早めていきたいと考えている。また、そのように計画が進行しつつある。
Strategy for Future Research Activity	１　PIP-FITCを用いて、ミトコンドリアDNAに確かにPIポリアミドが局在すること。その局在時間を確認することにより、ミトコンドリアDNAにPIポリアミドの効果を及ぼすにはどの程度の間隔で処理を行う必要があるかを確認する。２　研究に供しているHeLamt3243細胞の生物学的特性（MCT4,VEGF遺伝子発現等）を対照細胞株と比較し、PIポリアミドの効果を簡便に調べられる方法を検討する。即ち、PIポリアミドの効果があり、変異mtDNAが減少した場合のマーカーとなる特徴を検討する。これには、異常ミトコンドリアDNAの含有率の異なる３種類の細胞株を用いる。３　１に応じてFITCの修飾のないPIポリアミドを用いて細胞を処理し、２で明らかとなった生物学的変化を確認する。４　２種類のPIポリアミドについて、どちらがより効率よく異常ミトコンドリアDNAと結合するかを比較する。５　有効なPIポリアミドが得られた場合、MELAS3243A>G細胞を移植した免疫不全マウスでin vivoでの効果を検討する。
Causes of Carryover	代表研究者の体調不良による研究の遅れ。 PIポリアミド合成の困難さによる研究の遅れが理由です。
Expenditure Plan for Carryover Budget	細胞内小器官への局在を明らかにするための試薬が高額であること。また、培養細胞の生理学的比較研究、in vivoにおける移植・ポリアミド処理実験に、多額の費用を要する。また、細胞培養の人手が不足する場合には、短期に技術員の雇用も考える。