クロマチン免疫沈降・シークエンス法による変異GATA1標的シス・エレメントの検索

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461579
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 土岐 力 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50195731)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ダウン症候群 / GATA1 / 白血病

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症新生児の5～10％は前白血病（TAM）を発症し、その約30％は死に至る。また、寛解例の約20%は白血病 (ML-DS)を発症することが知られている。興味深いことにTAMとML-DSのほぼ全例に転写因子をコードするGATA1遺伝子の変異（GATA1s）がみとめられる。本研究の目的は、GATA1s の標的遺伝子を検索し、TAM、ML-DSの発症メカニズムを解明することである。具体的には以下の三点に課題を絞って研究を行なう。1. 変異GATA1を用いたシス・エレメントと標的遺伝子の同定。2. GATA1sの発現量の変化が標的遺伝子の発現に与える影響の検討。3. TAM発症に関わるGATA1ドメインの検索。
前年度(平成25年度)は、前述の第3の課題である「TAM発症に関わるGATA1の新規関連ドメインの発見」についての研究が進行中であることことを報告した。この研究は、弘前医学に報告することができた。この変異体は、非ダウン症例の急性巨核芽球性白血病例にみとめられたものだが、TAMやML-DS例にもあることが分かり（未発表）より詳細に検索を進めている。本研究2年目（平成26年度）の目標は、前述の課題1と２に関する研究も進めることであった。課題1については、当初GATA1変異体の発現誘導型ベクターを作製し研究を進めていたが、前報告書にも記した遺伝子改変技術CRISPRを用いた研究が進み、変異体GATA1を発現する細胞株の樹立に成功した。当初の目標でもあるクロマチン免疫沈降法を用いた解析も進み、本年度の目標はおおよそ達成することができた。課題2については、CRISPRによる変異体を複数樹立することができたことから、現在その解析を進めているところである。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度報告書に記した目標に従い、発現誘導型の実験系の確立に取り組んだがよい結果が得られなかったことがやや研究が遅れている原因になっている。これは対照実験となる完全長GATA1の誘導による細胞増殖の抑制が予想より強かったことに起因している。一方でこのような明確な表現型が確認できたことは研究方向が誤っていないことを示唆していると思われる。本年度は材料の細胞株を変更し、さらにCRISPRを取り入れることにより、安定した変異体を得ることができた。また課題だったクロマチン免疫沈降法と次世代シーケンサーの解析の組み合わせにも成功したことから、当初の目標に向けて研究が加速するものと考えている

Strategy for Future Research Activity

本年度は当初の計画を進めるための技術的な条件をほぼ全てクリアすることができた。今後は、CRISPRを用いて変異体の種類を増やし、樹立した変異体におけるGATA1sの発現量の測定や、変異ドメインによる機能的な差異を調べる予定である。樹立した複数の変異体に本年度確立した研究方法を用いることによって、より詳細なデータの蓄積を試みる。このデータを解析することにより本研究課題の解決を達成できると考えている。

Research Products

• [Journal Article] 非ダウン症小児急性巨核芽球性白血病にみとめられた新規GATA1インフレーム変異 (2014)
  • Author(s): 王汝南, 金崎里香, 土岐力, 照井君典, 佐々木伸也, 工藤耕, 神尾卓哉, 佐藤智彦, 池田史圭, 荒木亮, 落合英俊, 伊藤悦朗
  • Journal Title: 弘前医学 Volume: 65 Pages: 227-237
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant