2013 Fiscal Year Research-status Report

新規IL18阻害剤臨床応用研究及びβ-trefoil型サイトカイン分子標的薬探索

Research Project

Project/Area Number	25461588
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Gifu University
Principal Investigator	加藤善一郎岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90303502)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	IL-18 / 立体構造 / 複合体 / 創薬
Research Abstract	β-trefoil型サイトカインにおけるレセプタータンパク発現精製系の確立と構造情報の収集として、ターゲットとなるレセプター群の解析を行うことができ、その際、両者の非ラベル体及び各種ラベル体を種々の組み合わせで混合し複合体を形成させた後、分子間NMR情報をTransfered NOEなどの手法を用いて収集し、原子間距離情報（NOE）・原子の結合角情報（coupling定数）を用いた複合体構造の計算を行うことができた。同時に、NMRを用いたchemical shift perturbation法や表面プラズモン現象を応用した結合実験を行い、結合様式の詳細を解明した。さらに、タンパクのcDNAクローニング、細胞外ドメインの発現ベクター構築・蛋白発現を確認し、発現・精製系の確立・最適化を行うことができた。その結果、安定同位体ラベルしたタンパクを作成し、タンパクを構成するN末からC末までのアミノ酸の主鎖の各原子をNMRスペクトル上にアサインした。タンパクポリペプチド主鎖のアサインが終了後、chemical shift index法などを用いた二次構造の解析、そして、側鎖の原子を含めたタンパク構成全原子のアサインを行った。一方、複合体蛋白の結晶化・その立体構造決定に成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 当初の計画として、２５年度は、既存の候補分子の評価を行う予定であったが、その後の下記のごとく、次年度以降の計画であった部分についても研究を進展させることができた。 β-trefoil型サイトカインにおけるレセプタータンパク発現精製系の確立と構造情報の収集として、ターゲットとなるレセプター群の解析を行うことができ、その際、両者の非ラベル体及び各種ラベル体を種々の組み合わせで混合し複合体を形成させた後、分子間NMR情報をTransfered NOEなどの手法を用いて収集し、原子間距離情報（NOE）・原子の結合角情報（coupling定数）を用いた複合体構造の計算を行うことができた。同時に、NMRを用いたchemical shift perturbation法や表面プラズモン現象を応用した結合実験を行い、結合様式の詳細を解明した。さらに、タンパクのcDNAクローニング、細胞外ドメインの発現ベクター構築・蛋白発現を確認し、発現・精製系の確立・最適化を行うことができた。その結果、安定同位体ラベルしたタンパクを作成し、タンパクを構成するN末からC末までのアミノ酸の主鎖の各原子をNMRスペクトル上にアサインした。タンパクポリペプチド主鎖のアサインが終了後、chemical shift index法などを用いた二次構造の解析、そして、側鎖の原子を含めたタンパク構成全原子のアサインを行った。一方、複合体蛋白の結晶化・その立体構造決定に成功した。
Strategy for Future Research Activity	今後は、蛋白複合体解析としてのレセプターαとリガンドIL-18との複合体構造解析、レセプターαとレセプターβとリガンドIL-18との３者複合体構造解析をさらに推進する。一方で、決定した立体構造を基にしたin silico分子設計を行う。特に、論理的な蛋白工学的機能分子デザイン（rational design）によるアンタゴニスト・部分アゴニスト等（低分子及びペプチド）のスクリーニングを行う。新たに得られた候補薬剤を出発点として、さらなる活性増強をはかる。さらに、薬剤様低分子化合物をターゲットとして、薬剤分子を３次元構造として保有する、２次スクリーニング用セカンド分子データベースを作成する。現時点で利用可能な分子情報として、約１００万分子を対象とする。一方、我々が実験的に決定したタンパク原子座標をもとに、コンピューター上に立体構造・表面電荷分布・原子間相互作用力・van der Waals力・電磁力場等を構築する。上記の成果をもとに新規計算システムにより弱い制限にてコンピュータースクリーニングを行う。この際、現在までに得られている実験データを参照・組み込んだシステムにより設計する。その後、細胞機能解析・分子相互作用解析によりリファインする。