次世代シーケンサーによる小児骨髄異形成症候群と若年性骨髄単球性白血病の解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461611
• Research Institution: Gunma Institute of Public Health and Environmental Sciences
• Principal Investigator: 外松 学 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (70251113)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 泰秀 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (30238133) ; 大木 健太郎 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (50400966) ; 朴 明子 群馬県衛生環境研究所, 研究企画係, 研究員 (50450375)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 遺伝子 / ゲノム / マイクロアレイ / 癌 / 臨床

Outline of Annual Research Achievements

小児myelodysplastic syndrome(MDS)とjuvenile myelomonocytic leukemia(JMML)の発症分子機構を解明するために，それぞれ40例を対象にして、これまでPTPN11、RAS、CBLなどの既知の遺伝子異常の解析と全エクソン解析を行ってきた。
今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17とCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。CSF3R遺伝子の変異はMDSとJMMLではみられなかったがAMLでは534例中10例(1.87%)に変異がみられた。CALR遺伝子の変異は血小板増多症 (ET) 21例中１例にみられたが、MDSとJMMLではみられなかった。小児ETでのCALR遺伝子の変異は本邦では初症例である。
非ダウン症候群急性巨核芽球性白血病(non-DS-AMKL) 43例中CBFA2T3-GLIS2を12例(27.9%)、NUP98- JARID1Aを４例(9.3%)、OTT-MALを10例(23.6%)、MLL-AF9を２例(4.7%)、MLL-AF10を１例(2.3%)認め、OTT-MAL以外は予後不良であった。これらの症例におけるFLT3-ITD、KIT、RAS、WT1の各変異とMLL-PTDは比較的稀であった。
またダウン症候群のTAMからMDS/AMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、MDS/AMLへの移行にはコヒーシン複合体が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。またTAM細胞を移植したNGOマウスの作整とiPS細胞樹立によりTAMからMDS/AMLへの移行の機序の解明に貢献できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

小児MDSとJMMLの発症分子機構を解明するために，これまで小児MDS 40例とJMML40例で既知の遺伝子異常の解析と全エクソン解析を行ってきた。
今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17とCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。CSF3R遺伝子の変異はMDSとJMMLではみられなかった。AMLでは534例中10例(1.87%)に変異がみられた。エクソン14では２例が(PoT618I)、エクソン17では８変異（3例がframe shift変異、５例がミスセンス変異）であった。エクソン17に変異がみられた症例はすべてt(8;21) ５例を含む転座がみられ、10例中７例が生存中であった。
CALR遺伝子の変異は血小板増多症(ET) 21例中１例にみられたが、MDSとJMMLではみられなかった。AMLでは534例中10例(1.87%)に変異がみられた。小児ETでのCALR遺伝子の変異は本邦では初めての症例である。
融合遺伝子の解析では、non-DS-AMKL 43例中CBFA2T3-GLIS2を12例(27.9%)、NUP98- JARID1Aを４例(9.3%)、OTT-MALを10例(23.6%)、MLL-AF9を２例(4.7%)、MLL-AF10を１例(2.3%)認め、OTT-MAL以外は予後不良であった。
またダウン症候群のTAMからMDS/AMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、MDS/AMLへの移行にはコヒーシン複合体が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。またiPS細胞樹立の基盤整備によりTAMからMDS/AMLへの移行の機序の解明に貢献できた。

Strategy for Future Research Activity

エクソーム解析とターゲットリシーケンスについては、おおむね順調に進んだが、さらに多数例での新規に報告された遺伝子について検証を行い、臨床像との関係と機能解析を検討する。
１）標的遺伝子の同定と遺伝子性状の解析
解析した小児MDSとJMMLにおいてみい出された変異につき、次世代シーケンサーを用いて多数例でターゲットリシーケンスを行う。またheterodyplex mobility assay法、コロニーアッセイなどにより、腫瘍化との関連性のさらなる検証を行い、標的遺伝子の同定を試みる。並行して網羅的メチル化解析の結果より抽出した候補標的遺伝子に関しても同様の遺伝子の性状解析を行う。
２）メチル化の網羅的解析
メチル化の有無に関して網羅的に検討し、エピジェネティックな転写抑制機構の解明を試みる。検出されたメチル化領域に関しては、発現解析およびbisulfate sequencingによりvalidationを行い、さらに有用なものに関しては5-aza-deoxythidineによるin vitro assayも行う。

Causes of Carryover

平成26年度に小児MDS40例とJMML 40例の検討を行い、CALR遺伝子の変異はETの１例でみい出したが、CSF3R遺伝子の変異はみられなかった。AMLでは534例中10例(1.87%)に変異がみられた。ダウン症候群では既知の遺伝子に加え新規12遺伝子につきサンガーシーケンスにより検証を行い、新規遺伝子を同定し、その遺伝子を多数例でHiSeq2000とMiSeqを用いてターゲットリシーケンスを行っているところである。当初の計画よりMDSとJMMLの正常検体が入手できたのが少なかったこともあり、研究費120万円を次年度の症例を検討するために先送りした。これらを研究予定なので、PCR、シーケンスの試薬を中心に平成26年度の先送りした研究費を合わせて次年度の研究費を使用する予定である。エクソーム解析のキットも購入する予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成26年度に小児MDS 40例とJMML40例の検討を行い、CALR遺伝子の変異はETの１例でみい出したがCSF3R遺伝子の変異はみられなかった。AMLではCSF3R遺伝子の変異は534例中10例(1.87%)に変異がみられた。CALR遺伝子変異についてさらに詳細に検討する予定である。ダウン症候群では新規12遺伝子につきサンガーシーケンスにより検証を行い、さらに新規遺伝子を同定し、多数例でターゲットリシーケンスを行っている。当初の計画よりMDSとJMMLの正常検体が入手できなかったため、研究費の一部を次年度の使用のために先送りした。次年度はさらに正常細胞を入手し検討を行う。また小児MDSとJMMLで標的遺伝子のうち５遺伝子につきターゲットリシーケンスを行い、小児MDSとJMMLの原因遺伝子をみいだし、分子標的療法の分子遺伝学的基盤を構築する。

Research Products

• [Journal Article] 胆汁うっ滞 一過性骨髄異常増殖症(TAM)と肝障害. (2014)
  • Author(s): 朴 明子.
  • Journal Title: 周産期医学 Volume: 44 Pages: 1290-1292
• [Journal Article] Gene alterations involving the CRLF2-JAK pathway and recurrent gene deletions in Down syndrome-associated acute lymphoblastic leukemia in Japan. (2014)
  • Author(s): Hanada I, Terui K, Ikeda F, Toki T, Kanezaki R, Sato T, Kamio T, Kudo K, Sasaki S, Takahashi Y, Hayashi Y, Inukai T, Kojima S, Koike K, Kosaka Y, Kobayashi M, Imaizumi M, Mitsui T, Hori H, Hara J, Horibe K, Nagai J, Goto H, Ito E.
  • Journal Title: Genes Chromosomes Cancer. Volume: 53 Pages: 902-910
  • DOI: 10.1002/gcc.22201
• [Journal Article] Acute myeloid leukaemia with myelodysplastic features in children (2014)
  • Author(s): Kinoshita A, Miyachi H, Matsushita H, Yabe M, Taki T, Watanabe T, Saito AM, Tomizawa D, Taga T, Takahashi H, Matsuo H, Kodama K, Ohki K, Hayashi Y, Tawa A, Horibe K, Adachi S.
  • Journal Title: Br J Haematol Volume: 167 Pages: 80-86
  • DOI: 10.1111/bjh.12993
• [Journal Article] Cytogenetics and clinical features of pediatric myelodysplastic syndrome in Japan (2014)
  • Author(s): Moriwaki K, Manabe A, Taketani T, Kikuchi A, Nakahata T, Hayashi Y .
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 100 Pages: 478-484
  • DOI: 10.1007/s12185-014-1674-z
• [Journal Article] Liver disease is frequently observed in Down syndrome patients with transient abnormal myelopoiesis. (2014)
  • Author(s): Park MJ, Sotomatsu M, Ohki K, Arai K, Maruyama K, Kobayashi T, Nishi A, Sameshima K, Takagi T, Hayashi Y.
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 99 Pages: 154-161
  • DOI: 10.1007/s12185-013-1487-5
• [Journal Article] Mutations of the GATA2 and CEBPA genes in paediatric acute myeloid leukaemia. (2014)
  • Author(s): Shiba N, Funato M, Ohki K, Park MJ, Mizushima Y, Adachi S, Kobayashi M, Kinoshita A, Sotomatsu M, Arakawa H, Tawa A, Horibe K, Tsukimoto I, Hayashi Y.
  • Journal Title: Br J Haematol Volume: 164 Pages: 142-145
  • DOI: 10.1111/bjh.12559
• [Journal Article] SETBP1 mutations in juvenile myelomonocytic leukaemia and myelodysplastic syndrome but not in paediatric acute myeloid leukaemia. (2014)
  • Author(s): Shiba N, Ohki K, Park MJ, Sotomatsu M, Kudo K, Ito E, Sako M, Arakawa H, Hayashi Y.
  • Journal Title: Br J Haematol Volume: 164 Pages: 156-159
  • DOI: 10.1111/bjh.12595
• [Journal Article] Recurrent CDC25C mutations drive malignant transformation in FPD/AML. (2014)
  • Author(s): Yoshimi A, Toya T, Kawazu M, Ueno T, Tsukamoto A, Iizuka H, Nakagawa M, Nannya Y, Arai S, Harada H, Usuki K, Hayashi Y, Ito E, Kirito K, Nakajima H, Ichikawa M, Mano H, Kurokawa M.
  • Journal Title: Nat Commun. Volume: 5 Pages: 4770
  • DOI: 10.1038/ncomms5770
• [Presentation] The Prognostic Impact of High MEL1 Gene Expression in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. 56th ASH Annual Meeting and Exposition (2014)
  • Author(s): Shiba N, Ohki K, Hara Y, Yamato G, Park M, Ichikawa H, Kobayashi T, Tomizawa D, Sotomatsu M, Arakawa H, Horibe K, Taga T, Adachi S, Tawa A, Hayashi Y.
  • Organizer: 56th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: San Francisco
  • Year and Date: 2014-12-06
• [Presentation] Clinical Features of Patients with ASXL1 and ASXL2 Mutations in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. (2014)
  • Author(s): Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Ohki K, Park M, Hara Y, Tomizawa D, Sotomatsu M, Taga T, Adachi S, Tawa A, Horibe K, Arakawa H, Ogawa S, Hayashi Y.
  • Organizer: 56th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: San Francisco
  • Year and Date: 2014-12-06
• [Presentation] 小児急性骨髄性白血病におけるASXL1、ASXL2遺伝子変異と臨床像 (2014)
  • Author(s): 大和 玄季, 柴 徳生, 吉田 健一, 大木 健太郎, 朴 明子, 原 勇介, 外松 学, 多賀 崇, 富澤 大輔, 足立 壮一, 多和 昭雄, 堀部 敬三, 荒川 浩一, 小川 誠司, 林 泰秀.
  • Organizer: 第56回日本小児血液・がん学会学術集会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2014-11-29
• [Presentation] 芽球割合の低いTAMにおける臨床像の解析 (2014)
  • Author(s): 朴 明子, 新井 心, 大木 健太郎, 外松 学, 林 泰秀.
  • Organizer: 第56回日本小児血液・がん学会学術集会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2014-11-28
• [Presentation] ダウン症における一過性異常骨髄増殖症の形態学的特徴 JPLSG TAM-10形態中央診断の解析 (2014)
  • Author(s): 濱 麻人, 村松 秀城, 長谷川 大輔, 朴 明子, 岩本 彰太郎, 多賀 崇, 伊藤 悦朗, 柳沢 龍, 康 勝好, 林 泰秀, 足立 壮一, 水谷 修紀, 渡邉 健一郎.
  • Organizer: 第56回日本小児血液・がん学会学術集会
  • Place of Presentation: 岡山
  • Year and Date: 2014-11-28
• [Presentation] CSF3R and CALR mutations and cytogenetic findings in pediatric myeloid malignancies. (2014)
  • Author(s): Sano H, Ohki K, Park M, Shiba N, Hara Y, Sotomatsu M, Tomizawa D, Taga T, Kiyokawa N, Tawa A, Horibe K, Adachi A, Hayashi Y.
  • Organizer: 第76回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2014-11-01
• [Presentation] 芽球割合の低いTAMにおける臨床像の解析. (2014)
  • Author(s): 朴 明子, 外松 学, 新井 心, 大木 健太郎, 小林 富男, 丸山 憲一, 鮫島 希代子, 林 泰秀.
  • Organizer: 第117回日本小児科学会学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2014-04-13
• [Presentation] ダウン症における一過性異常骨髄増殖症の形態学的特徴 JPLSG TAM-10形態中央診断の解析 (2014)
  • Author(s): 濱 麻人, 村松 秀城, 長谷川 大輔, 朴 明子, 岩本 彰太郎, 多賀 崇, 伊藤 悦朗, 柳沢 龍, 康 勝好, 林 泰秀, 足立 壮一, 水谷 修紀, 渡邉 健一郎.
  • Organizer: 第117回日本小児科学会学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2014-04-13
• [Presentation] 小児急性骨髄性白血病におけるGATA2変異の解析. (2014)
  • Author(s): 原 勇介, 柴 徳生, 大木 健太郎, 朴 明子, 足立 壮一, 多賀 崇, 荒川 浩一, 多和 昭雄, 堀部 敬三, 林 泰秀.
  • Organizer: 第117回日本小児科学会学術集会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2014-04-12
• [Presentation] Recurrent CDC25C mutations drive malignant transformation in FPD/AML. (2014)
  • Author(s): Yoshimi A, Toya T, Kawazu M, Ueno T, Tsukamoto A, Iizuka1 H, Nakagawa M, Nannya Y, Arai S, Ichikawa M, Harada H, Usuki K, Hayashi Y, Ito E, Kirito K, Nakajima H, Mano H, Kurokawa M.
  • Organizer: AACR Annual Meeting 2014
  • Place of Presentation: San Diego, U.S.A.
  • Year and Date: 2014-04-05 – 2014-04-09