筋収縮調節タンパク質のリン酸化を指標とした酸素感受性動脈管の収縮弛緩のメカニズム

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461656
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 竹内 大二 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (40328456)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中西 敏雄 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (90120013)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 血管 / 平滑筋の収縮 / タンパク質 / リン酸化

Research Abstract

本研究の目的は、酸素感受性の血管である動脈管や臍帯動脈が酸素濃度の変化に応じて収縮弛緩する機序を、筋収縮調節タンパク質群のリン酸化を指標にして詳細に検討することである。血管の収縮は血管平滑筋のミオシン-アクチン結合から生まれる。そのミオシンのアクチンとの結合を調節するミオシン調節軽鎖LC20）やこのリン酸化を担うミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）のリン酸化など、平滑筋の収縮・弛緩を制御するリン酸化を詳細に検討することにより、酸素感受性の血管の収縮の機構（パスウェイ）を生化学的に明らかにする。
本年度は、血管に収縮・弛緩の刺激を与え、筋収縮調節タンパク質のリン酸化を詳細に検討する。正常コントロールとして、妊娠21 日（成熟）、19 日（未熟）胎仔、新生仔、成獣ラットから大動脈など様々な血管を採取し、血液などを除去して試料とした。妊娠21 日胎仔の動脈管と肺動脈や成獣の大動脈を用いて、窒素（95% N2-5% CO2）及び酸素（95% O2-5% CO2）飽和Krebs-Henseleit 緩衝液中やKCl添加条件で37℃培養し、 in vitro刺激試料を得た。これらの血管試料から脱リン酸化阻害剤存在下でタンパク質を抽出し、フォスタグSDS-PAGEを行い、イムノブロットを調製した。これまでに、ターゲットタンパク質（ミオシン調節軽鎖, LC20など）のリン酸化の分離に適したフォスタグ電気泳動のゲルやフォスタグの濃度の条件検討を実施した。フォスタグ電気泳動法では、泳動分離した蛋白質バンドが乱れやすいため良好な分離条件を設定するために苦心した。ミオシン調節軽鎖のリン酸化バンドの分離には、フォスタグ濃度は50μM以上、ポリアクリルアミド濃度は10-12%が良好であることがわかった。これまでに、コントロールの各種血管や高酸素低酸素処理やKCl処理した試料でリン酸化が検出されている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに、リン酸化検出のためのフォスタグを用いた電気泳動法の基本的な分離・検出の手法とこつを習熟できた。ラットを用いた各種の収縮弛緩刺激を与えた血管試料も調製済みであることから、次年度において、さらに詳細な分離解析に進むことが可能な段階にきているので。

Strategy for Future Research Activity

本研究においては、ターゲットタンパク質ごとに、一次元フォスタグ電気泳動でリン酸化を良好に検出できる条件を設定することが、最も大切である。この条件検討を残りのターゲットタンパク質に対して引き続き実施する。さらに、二次元電気泳動を併用したリン酸化の検出法を確立する。すでに様々な血管収縮弛緩刺激を与えたラット血管試料を調製してあるが、加えて、特に動脈管・肺動脈に対して、精密な分離・結果の評価ができるように、リン酸化検出実験を継続する予定である。