2013 Fiscal Year Research-status Report
プラスミンをターゲットとした水疱性類天疱瘡の発症機序解明
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25461661
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
中村 秀樹 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助手 (60435956)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西江 渉 北海道大学, 大学病院, 講師 (20443955)
夏賀 健 北海道大学, 大学病院, 助教 (70645457)
清水 宏 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00146672)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 自己免疫性水疱症 / 水疱性類天疱瘡 / COL17 |
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| Research Abstract |
水疱性類天疱瘡（bullous pemphigoid）は、表皮真皮境界部に存在する17型コラーゲン（COL17）に対する自己抗体により生じる自己免疫疾患である。BPはCOL17に対する自己抗体の結合と、その後の炎症により発症すると考えられているが、その際タンパク分解酵素であるプラスミンがBPの病変部で発現亢進していることが知られている。本研究の目的は、BPの水疱形成におけるプラスミンの関与について解明することである。
平成25年度は、COL17A1 cDNAを安定発現する哺乳類由来である293細胞からCOL17タンパクをアフィニティー精製し、精製した全長のリコンビナントCOL17タンパクをプラスミンで消化した。SDS-PAGE後、COL17の細胞外領域に該当する120kDのバンドをクマシー染色後に切り出し、トリプシン処理後、マススペクトロメトリー（nano-LC/LC-MS）にて切断部を同定した。その結果、生理的部位とは異なる部位（非コラーゲン領域であるNC16A内の508番目セリンSer508のアミノ末端）で切断されることが判明した。プラスミンによる切断部位が同定されたことから、Ser508から8アミノ酸のペプチドを合成し、2匹の野兎へ免疫し、プラスミンによって生じる切断部に対する特異抗体の作製を開始した。抗原ペプチドカップリングカラムによって切断部特異抗体をアフィニティー精製しウェスタンブロットを行ったところ、プラスミンによって消化されたCOL17断片に反応することが確認された。次に、凍結正常ヒト皮膚切片を薄切切片上でプラスミンと反応させ、作成した切断部位特異抗体で染色したところ、表皮真皮間境界部に線状に沈着することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画書に作製した通り、COL17のプラスミンによる切断部位が同定され、プラスミン切断時に生じる切断部を特異的に認識する抗体の作製にも成功したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画書に記載した通り、次の4項目について推進していく予定である。
１．BP病変部におけるCOL17のプラスミン切断の評価：プラスミン切断部位認識抗体を用い、多数例のBP患者皮膚について、プラスミンによるCOL17の切断の有無を免疫組織学的に確認する。（平成26年度）
２．プラスミン切断の有無と臨床症状との相関評価：BPの臨床症状と病変部皮膚におけるプラスミン切断の有無の相関関係を明らかにする。（平成26年度）
３．BPモデルマウスへのプラスミンの投与：ヒトCOL17を発現する遺伝子改変マウスへ、BP患者IgGに加えプラスミンを投与することで生じる病変の重症度と水疱発症の有無について検討する。（平成27年度）
４．プラスミン阻害剤による水疱形成阻害効果の検討：BPモデルマウスへプラスミン阻害剤を投与し、水疱形成阻害効果の検討を行う。（平成27年度）
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