2013 Fiscal Year Research-status Report
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25461667
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
松井 毅 独立行政法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (10452442)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
諸根 信弘 京都大学, 物質ー細胞統合システム拠点, 特定拠点講師 (50399680)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 皮膚 / 表皮 / 角質層 / 保湿 / 細胞 / アトピー性皮膚炎 / バリアー / プロテアーゼ |
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| Research Abstract |
皮膚表皮の角質層は、保護・バリアー機能・保湿などの重要な機能を果たしている。最近、申請者らは、皮膚顆粒層特異的プロテアーゼSASPaseを欠損させたマウスは、アトピー性皮膚炎の最大の疾患素因蛋白質であるProfilaggrinの分解異常を伴う乾燥肌になることを明らかにした。このマウスの顆粒層が、なぜ保湿不全の角質層を形成するのかを明らかにすることは、アトピー性皮膚炎や角化症の理解に重要である。
本年度は、既に予備実験としては行われていた顆粒層の最上層SG1細胞の分離手法の再確認とその至適化を行った。SG1細胞にGFPを特異的に発現するヘアレスマウス系統を用いて、SG1細胞を分離する手法を至適化した。現在までの所、マウス皮膚表皮からのトリプシン処理により、多角形をとり、細胞内に顆粒が存在する顆粒層細胞が分離される方法を確立し、それらの中に、GFP陽性・陰性細胞が混在していることが明らかとなった。GFP陽性細胞は、表皮の凍結切片上の解析では、SG1に相当すると考えられる。また、分離した顆粒層細胞の細胞表面の蛍光ラベルを行い、共焦点顕微鏡を用いて形状解析を行う方法も至適化した。その結果、マウス表皮の顆粒層の細胞は、中央部に凹みのあることにより、横断面では鎌形の形状をしていることが明らかとなった。また形状は変化してしまうが、サイトスピン（Thermo Scientific社）によって、このSG1細胞を含む細胞集団をカバーグラス上に貼り付ける手法も至適化した。この方法を用いることにより、実際にSG1細胞に発現していると考えられる表皮分化マーカー(Loricrin, Involucrin, SASPase, Filaggrin等)に対する免疫蛍光抗体染色による解析が可能になった。以上のように本年度は、SG1細胞の表皮からの分離法と細胞生物学的解析手法の確立を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度は、京都大学 物質-細胞統合システム拠点から理化学研究所 横浜事業所 統合生命医科学研究センターに研究室の移動があり、研究室の立ち上げ、実験材料（マウス系統など）の移動を行ったため、実験室が稼働する9月までは、予定通りの研究は進められなかった。ただし、京都大学 物質-細胞統合システム拠点にて行われていた実験系と同様のシステム、試薬、実験条件を整えることを完了し、遺伝子組み換えマウスも順調に施設間で移動、繁殖を行うことができてはいることから、次年度からは通常通りの計画で進めることができると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度以降は、顆粒層細胞の分離法をさらに至適化し、タイムラプス撮影の手法を確立する。また、分離できた顆粒層細胞の微細構造解析を理化学研究所や京都大学iCeMSの電子顕微鏡施設を利用して解析する。ヘアレスマウスへのエレクトロポレーションによる蛍光蛋白質導入の条件を至適化することにより、上記タイムラプス撮影時に、どのような蛋白質やそれらにより形成される構造が、動的に変化しているのかを解析する。最終的には、乾燥肌を示すSASPase KOマウスからの顆粒層細胞分離や、ヒト三次元皮膚モデルからの顆粒層細胞分離に着手していく。
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