2016 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of moisturization mechanism of stratum corneusm
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25461667
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
松井 毅 国立研究開発法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 副チームリーダー (10452442)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
諸根 信弘 京都大学, 物質－細胞統合システム拠点, 客員教授 (50399680)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 皮膚 / 表皮 / 角質層 / 保湿 / 細胞 / アトピー性皮膚炎 / バリア / プロテアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
皮膚表皮の角質層は、保護・バリアー機能・保湿などの重要な機能を果たしている。申請者らは、以前に皮膚顆粒層特異的プロテアーゼSASPaseを欠損させたマウスは、皮膚表皮顆粒層特異的蛋白質でありアトピー性皮膚炎関連遺伝子をコードするProfilaggrinの分解異常を伴う乾燥肌を呈することを明らかにしていた。このマウスの顆粒層が、なぜ保湿不全の角質層を形成するのかを明らかにすることは、アトピー性皮膚炎や角化症の理解に重要であると考えられる。
本年度は、昨年度までに至適化した分離法をさらに改良し、懸濁する際の培地の組成を検討した。その結果、1mM以上のCa2+の存在化において、細胞内カルシウム濃度の一過性の上昇が認められることが明らかになった。また、分離後の迅速な処理が細胞死における核の凝縮に対して大きく影響することも明らかになった。タイムラプス撮影前後にSG1細胞の透過・走査電子顕微鏡観察を行い、光学顕微鏡像と電子顕微鏡を相関させるサンプル調製法も確立した。本来SG1細胞は、通常の培地存在下では、ポリリジンコートなどガラスボトムDishをコートして観察を行うと、正常なpHとCa2+による細胞死過程が観察されないことから、ノンコートのカバーグラス上でタイムラプス撮影を行い、固定液添加後に付着している細胞をタイムラプス動画と合わせて同定することにより、細胞死・分化後の細胞形態を観察できるようになった。その結果、SG1細胞は、通常の動物細胞とは異なり、表面上に細かい規則的な隆起を持ちつつ、微絨毛を有するが、細胞死後には、扁平な構造へと変化していることが明らかとなった。最終年度は、これまで確立したSG1分離培養系を用いて、実際に角質層の機能異常が認められる、SASPase, FIlaggrin欠損マウスにおける顆粒層の細胞生物学的解析を行い、どのような構造的な破綻が角質層機能異常へと結びつくのかを明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SG1細胞分離系の安定化に困難が生じていたが、分離するまでの時間や培地を至適化することにより、細胞内カルシウム濃度の一過性の上昇が安定的に認められることが明らかになった。また、分離後の迅速な処理が、細胞死における核の凝縮現象に対して大きく影響することも明らかになった。また、タイムラプスを行った後にSG1細胞の走査電子顕微鏡観察をするサンプル調製法も確立した。SG1細胞は、通常の動物細胞とは異なり、表面上に細かい規則的な隆起を持ちつつ、微絨毛をことが明らかとなり、特殊な細胞膜構造を持っていることが明らかとなった。以上のように分離したSG1細胞に対して光学顕微鏡レベル・電子顕微鏡レベルで多彩な解析系を確立することができたことからおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、これまで確立したSG1分離培養系を用いて、実際に角質層の機能異常が認められる、SASPase, Filaggrin などにおけるケラチンの構造変化を観察し、それぞれの角質層異常がどのようなケラチン配向に基づくのかを明らかにする。またケラチン、微小管、アクチンなどの細胞骨格蛋白質を蛍光蛋白質で可視化することにより、どのような細胞内構造異常が起きているのかも明らかにし、最終的には論文にまとめる。
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| Causes of Carryover |
研究分担者の実験計画において、SG1細胞の調製法や培養条件の至適化に時間がかかったため、電子顕微鏡のサンプル調製のスケジュールがずれ、次年度へ、くりこさざるを得ない状況となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度で、電子顕微鏡用試料の調製法が確立したため、繰り越し分は、電子顕微鏡試料作製・解析費、研究分担者の旅費に充当する予定である。
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