I型コラーゲン転写活性化因子(COLF2)の精製とcDNAクローニング

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25461675
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 籏持 淳 獨協医科大学, 医学部, 教授 (90172923)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: I型コラーゲン転写活性化因子 / ヒトα1鎖I型コラーゲン遺伝子(COL1A1) / DNA エレメント / DNA‐アフィニティークロマトグラフィー / 真皮線維芽細胞

Research Abstract

私共はヒトα1鎖I型コラーゲン遺伝子COL1A1上流域のdeletion 解析を行っており、すなわちexonuclease IIIを用いたHenikoffの方法で転写開始点方向へのdeletionを-804より-332の位置までの種々の長さの(-804,-610,-517,-402,-332)欠失変異体キメラ遺伝子を作成、これを用いてルシフェラーゼアッセイ等の一過性発現実験でdeletion 解析を行い、-332から-402のDNA断片上に転写を上昇させるDNAエレメントが存在していることを明らかにした。そしてさらなるアッセイにより-386から-371に結合する因子の存在することを証明した。私共はこの因子をCOLF2と名付けた。この因子のコンセンサスな結合配列の予想をGenomatixMatinspector (Cartharius K et al:Bioinformatics21:2933-2942, 2005)で検索した結果、相同性の高い因子はなく、COLF2が新奇の因子である可能性が高いことが明らかにされた。そこで種々のsubstitution mutation を加えた断片を用いたGel mobility shift assay でcompetition assay などにより結合する配列を明確にすることが次の大量培養-精製のためのDNA‐アフィニティークロマトグラフィー作成にきわめて重要であるのだが、この部分での予備実験が予定どおり行かず、手こずっている状態である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

種々のsubstitution mutation を加えた断片を用いたGel mobility shift assay でcompetition assay などにより結合する配列を明確にすることが次の大量培養-精製のためのDNA‐アフィニティークロマトグラフィー作成にきわめて重要であるのだが、この部分での予備実験が予定どおり行かず、手こずっている状態である。ここを乗り越えることで研究は順調に進むと考えております。

Strategy for Future Research Activity

種々のsubstitution mutation を加えた断片を用いたGel mobility shift assay でcompetition assay などにより結合する配列を明確にする。
ヒト真皮線維芽細胞を大量培養しlysate を作成する。
そして合成オリゴDNA を用いたDNA‐アフィニティークロマトグラフィーで部分精製する。さらに高速液体クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどを用いてさらに精製する。その後精製した蛋白のペプチドシークエンスを行い、それを用いてcDNAクローニングを行う予定である。