2014 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
25461709
|
|---|
| Research Institution | Jichi Medical University |
|---|
Principal Investigator |
津田 英利 自治医科大学, 医学部, ポストドクター (30414923)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | ケラチノサイト / IL-33 / 細胞内局在 / 細胞周期 / 細胞質分裂 / プロモーター |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成25年度の報告において、IL33をケラチノサイト内でノックダウンすると、細胞周期においてG2/M期の細胞集団が増えることを明らかにした。細胞数が増えない理由には、細胞の増殖が止まる場合と、アポトーシス等の細胞死が起こる場合と二通りが考えられる。そこで、アポトーシス検出の為AnnexinV染色を行った。その結果、コントロール細胞及びノックダウン細胞いずれにおいてもAnnexinV陽性細胞を検出することは出来ず、アポトーシスは誘導されないことが判った。
また、G2/M期のいずれにおいて細胞周期が止まっているのか明らかにするためにM期のマーカーとG2期のマーカーの発現量を比較したが、ノックダウン細胞とコントロール細胞では大きな違いは見られなかった。蛍光染色した細胞を観察した結果、ノックダウン細胞では核が2つある細胞が多く見られた。このためG2/M期(4n)の細胞が増えていたことが判った。
また、IL-33のプロモーター解析を行うためにIL-33に3つ報告されているexon1を含む上流2.5kbpの領域をPCRにて増幅して、ホタルルシフェラーゼの上流にクローニングした。これら3つのexon1を上流からexon1a, exon1b, exon1cとした。ケラチノサイトにトランスフェクションすると、exon1bを含むコンストラクトが最も活性が高く、IFNγで刺激をするとa, b, cいずれでも反応が見られるが、fold changeが一番大きかったのはexon1bであった。またexon1bのdeletion mutantを作製し、おおまかなプロモーター活性領域を絞り込むことが出来た。
昨年度構築したIL-33のスプライスバリアントをケラチノサイトにトランスフェクションした。核移行シグナルを持っていない、293細胞では細胞質に局在していたバリアントを含める全てが核に局在していた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
IL-33をケラチノサイト内で安定的にノックダウンする条件を確立し、IL-33がノックダウンされた時の、細胞機能解析は順調に進んでいると考えている。現在、細胞分裂に問題があるとの仮説のもと、随時検証を進め、それらが全てこの仮説を裏付けるものとなっている。
また、IL-33のプロモーター解析であるが、exon1bの活性が一番強いこと、またdeletion mutantの作製により、おおまかなプロモーター領域を同定することが出来た。
IL-33のスプライスバリアントであるが、こちらはケラチノサイトに形質転換することは出来たが、293細胞の時と全く違う局在を示すこととなった。すなわち、293細胞においては、核移行シグナルを持つものは核に局在し、核移行シグナルを持たないバリアントでは、細胞質に局在するため、細胞全体が染まる結果であった。しかし、ケラチノサイトの場合、全てのバリアントにおいて、核にのみ局在が見られた。これは予想しなかったことであった。よってこれらは、視点を変えて、新たな実験計画をたてるものとする。
|
| Strategy for Future Research Activity |
IL-33をノックダウンした際に2核の細胞が出来る様子を、動的に観察することが必要であると思われた。すなわち、可能性としては、mitosisが終了し、細胞質分裂が不完全で1細胞内に2核が存在するのか、それとも全く別々の細胞が出会って融合するのか、により、IL-33の核内の存在意義とその後の解析に大きな違いが生じると考えられる。
まずは、IL-33をノックダウンした細胞をガラスボトムディッシュに播種し、細胞分裂の様子を、顕微鏡を用いてタイムラプス観察することを計画している。初代培養であるため、細胞質や細胞膜にマーカー遺伝子を形質転換したり、蛍光色素での染色が難しいと考えられるため、位相差にて観察を試みる。顕微鏡による動的観察によって、細胞分裂されずに2核になるのか、それとも細胞融合が頻繁に起こるのか、いずれか明らかになった場合、それぞれのメカニズムについても検討を行う。
また、IL-33のスプライスバリアントの細胞内局在の確認であるが、再度ケラチノサイトに形質転換を行い、もう一度局在を確認する。また、形質転換後にIL-33を誘導することが確認されているIFNγを始めとするサイトカインによる刺激を行い、局在に変化が起こるか否か、確認することとする。
IL-33のプロモーター解析については、様々なサイトカイン刺激により、STATの関与が示唆されており、また、最近の海外からマウスIL-33の転写にはSTAT1が重要な役割を果たすとの報告が出された。よって、ヒトIL-33の転写もSTAT1により制御されているのかそれともSTAT3も関与するのか、または他のシグナルパスウェイの関与もあるのか、を阻害剤や、STAT1, 3のドミナントネガティブ分子を用いた実験により、明らかにしていく。
|
| Causes of Carryover |
本年度の実験において、前年度に作成したベクターの使用で十分実験が行えたため、予想よりも使用額が少なくなった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度はマウスを用いた実験を計画している。うち、KOマウスに関しては本研究室にて飼育、繁殖を行うが、対象となる野生型に関しては購入が必要となる。条件検討なども行い、マウスの必要数が増えることが予想され、またパラメーター解析に余剰分を確保しておく必要があるため、それらに繰越分を当てる。
|
