2013 Fiscal Year Research-status Report
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25461710
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
山上 淳 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (80327618)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 勇人 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (40398615)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 天疱瘡 / 自己免疫疾患 / 濾胞ヘルパーT細胞 / 自己反応性B細胞 |
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| Research Abstract |
天疱瘡は、表皮角化細胞同士の接着分子であるデスモグレイン（Dsg）に対する自己抗体により生じる自己免疫疾患である。自己抗体の産生には、Dsg特異的B細胞の活性化が不可欠と考えられるが、その機構はまだ明らかにされていない。近年、二次リンパ組織の濾胞胚中心に存在する濾胞ヘルパーT細胞（Tfh）が、B細胞の活性化および分化と抗体産生において重要な役割を果たすことが報告されてきた。本研究は、天疱瘡におけるDsg特異的B細胞とTfhの解析を通じて、自己抗体産生機構の解明をめざしている。
本年度は、まず天疱瘡患者の末梢血中から、フローサイトメトリーでTfhの特徴を有する細胞（Tfh様細胞）が検出できるかを検討した。まず、慶應義塾大学病院皮膚科に通院または入院中の未治療の尋常性天疱瘡および落葉状天疱瘡患者の末梢血から単核球を抽出した。フローサイトメトリーでCD3およびCD4陽性の細胞集団を展開して、Tfhのマーカーとして知られるCXCR5およびPD-1を高発現している細胞をTfh様細胞として観察した。PD-1のみでは検出が難しいことも予想されたため、ICOSを用いた観察も行った。
その結果、天疱瘡患者の末梢血単核球で、CXCR5とICOSを強く発現しているTfh様細胞が、CD3およびCD4陽性細胞のうち3%から5%で確認された。ステロイドによる治療で血清中の抗Dsg抗体が減少すると、10例の天疱瘡患者のうち、7例で末梢血中のTfh様細胞の割合が減少していた。
この系で検出されたTfh様細胞が、実際にDsg特異的B細胞を活性化する能力を持つかどうかの評価系の確立を、現在試みている。同時に、天疱瘡モデルマウスを用いて、脾臓やリンパ節におけるTfhの局在、Dsg特異的B細胞との相互作用の解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
天疱瘡患者の末梢血においてTfhと同様のマーカーを発現している細胞を検出できたことで、末梢血中Tfh様細胞を単離するために検討していた戦略が有効と考えられたため、本研究の進展に明るい兆しが見えた。また、天疱瘡モデルマウスの作成は順調に進んでおり、ヒトとマウスの両面から天疱瘡におけるTfhの解析を行う準備が整いつつある。
次の段階として、現在は天疱瘡患者の末梢血中のDsg特異的B細胞の単離を試みている。同様に末梢血中のTfh様細胞の単離を進め、相互作用の評価を行う予定である。具体的には、末梢血Tfh様細胞とDsg特異的B細胞を反応させ、Dsgの組み換え蛋白を撒布したプレート上のELISPOTで、Dsgに対する抗体産生が増強するかを観察する。Tfh様細胞とTfhの表面マーカーを持たない末梢血CD4陽性T細胞群との比較、またDsg特異的B細胞と末梢血単核球中の全B細胞、および全単核球との比較をそれぞれ行うことで、B細胞の活性化・分化・抗体産生におけるTfh様細胞の作用を検討する。
天疱瘡モデルマウスは、Dsg3欠損マウスをDsg3の組み換え蛋白で免疫し、その脾細胞を免疫不全マウス（Rag2欠損マウス）に移入することで作成される。モデルマウスを用いることにより、各臓器および部位ごとにDsg3特異的B細胞およびTfhの局在を検討することが可能であり、またリンパ濾胞でのTfhの作用を解析できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
Tfh様細胞によるDsg特異的B細胞の活性化機構の評価系の確立を最優先課題として、特に以下の視点を常に念頭におきながら、本研究を推進していく。
B細胞との相互作用を起こすTfh様細胞の機能に重要な分子を検討する。Tfhの分化に必要とされるBcl-6に加え、これまでの研究からICOS、SAP、IL-21などの発現を検討する必要がある。さらにDsg刺激を加えたTfh様細胞について、ELISPOTでサイトカイン産生についての検討を行う。
B細胞の活性化に必要なサイトカインとしてIL-4、IL-21などが知られている。この評価系でDsg特異的B細胞が活性化された場合、Bcl-6、ICOS、SAPなどの転写制御因子およびTh1、Th2、Th17それぞれの系のヘルパーT細胞に関連するサイトカイン、ケモカインの発現についてRT-PCRで評価する。
Tfh様細胞により活性化されるB細胞の特徴を検討する。末梢血リンパ球をあらかじめCD23など活性化B細胞の表面マーカーとして知られる抗体で標識しておき、Tfhと反応するB細胞の集団をフローサイトメトリーで展開して、亜集団として標識できる表面マーカーについて検討する。
同一の天疱瘡患者において、病勢の強い活動期と病変の新生がない寛解期で、Dsg特異的細胞とTfh様細胞との相互作用を比較する。治療により病勢が低下した患者においては、B細胞に対する相互作用の強弱、Bcl-6、ICOS、SAP、IL-21といった分子の発現について各病期を比較する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品を主体に研究費を執行しており、研究室で所有していた試薬を使用したことで研究費を節約できたためと考えられる。
当初の予定どおり、消耗品費を中心に使用する予定である。今後は、フローサイトメトリー用の抗体やマウスに関連する費用などが増加すると予想される。
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