2014 Fiscal Year Research-status Report
Aβ産生機構の変化に関連する新規分子群の脳脊髄液中での探索
| Project/Area Number |
25461766
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
児玉 高志 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任研究員(常勤) (30512131)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田上 真次 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40362735)
大河内 正康 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90335357)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | バイオマーカー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度、APL1betaペプチドの切断パターンの変化と連動して変化する他の分子群を探索することを目的として、ヒト脳脊髄液に対してゲル濾過による分子量の分画を行い、LC/MS/MS型質量分析装置を用いてIDA（Information Dependent. Acquisition）測定によりどのような分子種が測定されるか調べたところ、様々な分子量の非常に多くの分子が存在することが分かった。また、この結果をもとに、400種類を超えるペプチドを同定したが、これらのペプチドに由来するシグナルは、測定の際に完全に分離、定量することが困難であった。
APL1betaペプチドの存在量、もしくは存在比の変化と並行して量が変動する未知の分子群を探索するためには、それぞれの検体における各候補ペプチドの相対的な量を正確に定量して比較する必要がある。そこで、ヒト脳脊髄液中に存在するペプチド群を、さらにその性質によって分離することを目的として実験を行った。その結果、ゲル濾過による分画を行った後、さらにペプチドの荷電の違いによる分離のためイオン交換カラムを用いると、広い範囲の塩強度のグラジエントに沿ってペプチドが展開できることが分かった。そこで、ゲル濾過とイオン交換カラムを組み合わせた方法で処理したヒト脳脊髄液について、イオン交換カラムでのフラクションごとに、LC/MS/MS型質量分析装置によるIDA測定によりどのような分子種が測定されるか調べた。その結果、ヒト脳脊髄液中を上記のように処理した後の各フラクションについても、まだ、多数のペプチドに由来するシグナルは、測定の際に完全に分離することが困難で、それぞれのシグナルが相互に重なり合うようにして観測されてしまうことがわかった。一方、参照とする予定の三種のAPL1betaペプチドに関しては、質量分析装置によるMRM（Multiple Reaction Monitoring）測定によって、高感度で定量する系を確立することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
APL1betaペプチドに関しては、LC/MS/MS型質量分析装置による測定で高感度定量する方法が確立した。一方、ヒト脳脊髄液中に存在する因子をLC/MS/MS型質量分析装置による測定で同定、定量する方法に関しては、ゲル濾過とイオン交換カラムを組み合わせた方法で試料の前処理を行って、各フラクションに含まれるペプチドに関する解析を行ったが、ペプチドに由来するシグナルを完全に分離することが困難で、多数のペプチドが、それぞれのシグナルが相互に重なり合うようにして観測されることがわかった。当初、LC/MS/MS型質量分析装置による測定に関しては、IDA測定などの網羅的な測定法によって候補となるペプチドを探索し、その後MRM（多重反応モニタリング）測定などの方法でこれらのペプチドのヒト脳脊髄液中での存在量について正確に定量して比較する戦略を考えてきたが、これらの結果から、質量分析に関しても網羅的な方法を回避して、培養細胞や培養上清を用いた系から得られる情報などを利用して、直接MRM測定などで選択的に定量を行う方が良いのではないかということが明らかになった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまでヒト脳脊髄液の精製の度合いを上げることより、そこに含まれるペプチドの定量的な比較が可能な条件を探そうと試みてきたが、生化学的な方法による分離には限界があることも見えてきた。そこで今後は、ヒト脳脊髄液の精製の度合いを上げることだけでなく、他の方法、例えば、培養細胞や培養上清を用いた系から得られる情報などを利用することを考え、引き続き、ヒト脳脊髄液中に存在する様々な因子の同定と定量のための条件の検討を続ける。
|
| Causes of Carryover |
一部で、当初計画していた実験と実際の進捗の状況に差異が生じたため、今年度、必要となると予想していた経費の一部を今後の段階で使用すること が必要となったから。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
概ね当初の研究計画の方向に沿って今後の研究を進めるが、今年度までの結果をふまえて、細かい点で作業の進め方に関して変更を加えた形で実験を行っていく。
|
