2013 Fiscal Year Research-status Report

ミニブタ脳死ドナー/臓器への一酸化炭素投与の移植臓器生着延長効果と臓器間の相違

Research Project

Project/Area Number	25461965
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	平方敦史日本医科大学, 医学部, 助教 (40468765)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山田和彦鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (40241103) 佐原寿史鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 特任准教授 (90452333)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	移植・再生医療 / トランスレーショナルリサーチ / 虚血再灌流障害 / ミニブタ / 一酸化炭素
Research Abstract	深刻なドナー不足に対するドナー適応拡大の際は、虚血再灌流障害IRIによる急性臓器不全や急性・慢性拒絶の発生増加が懸念される。種々の細胞保護効果を有する一酸化炭素COに着目し、炎症前駆物質の活性化が組織傷害を惹起する脳死ドナー個体や臓器へのCO投与による臓器保護効果に基づいた、ドナー拡大および移植成績の向上を目指す前臨床研究を立案した。脳死ミニブタへのCO投与によるIRI抑制・移植臓器生着延長効果の多臓器移植での評価を目的とした実験として、7頭のクラウンミニブタに対し、12日間持続タクロリムス投与下にMHC完全不適合肺移植を行った。硬膜外バルーン拡張による脳死誘導3時間後からドナーに対し250ppmのCO吸入を3時間行ったBD+CO群（n=4）と、CO吸入を行わない脳死誘導6時間後のドナー肺を用いたBD群（n=3）に分類し、移植肺生着および術後早期の機能を評価した。まずBD群では、これまでの自験例である非脳死ドナーからの肺移植に比べ、有意に拒絶反応が促進することを確認した。一方、BD+CO群では生着期間はBD群に対し有意に延長した。更に、脳死3時間までに上昇を始めたグラフト内炎症性サイトカイン発現はCO投与により著明に抑制されること、BD+CO群では移植肺静脈PO2はBD群より有意に良好であること、組織学的にも再灌流2時間および2日目の肺生検で、IRIの抑制を認めた。このように、脳死ドナーに対するCO吸入がもたらす臓器保護作用が早期移植肺機能改善のみならず長期生着延長に寄与することが大動物モデルで明らかとなった。当初は脳死18時間後から6時間のCO投与を行う予定であったが、準備実験で、脳死3時間後には肺内での炎症性サイトカイン上昇を認めること、これまでの実験で3時間のドナーへのCO吸入で効果が得られたことから計画を変更した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 脳死ドナーからの肺移植時に、脳死ドナーに対してCO投与を行うだけで治療効果が得られたという点は、今後の実験実施（他臓器である腎臓での効果、臨床応用性の高い投与方法の検討）など、実験を進めるにあたって非常に大きな達成であると考える。平成25年度は、脳死ドナーからの腎移植実験まで着手することはできなかったものの、すでに実験モデルが確立していることから、肺移植実験の結果を参照として、円滑な実験進行が期待される。
Strategy for Future Research Activity	平成26年度はまず、平成25年度に行えなかった腎移植実験に着手し、脳死ドナーへの3時間CO吸入が移植腎生着延長効果を有するか、という点を明らかにする。次いで、ガス吸入は、臓器間で効果に相違が生ずる可能性があること、更に臨床応用性を考慮するとCO吸入はより安全に配慮する必要が生ずるため、代替的投与法の検討が必要であることから、近年注目されているCO放出物質CO-releasing molecule（CORM）を脳死ドナーへ投与し、効果を検討する（CORMは投与後体内でCOを産生するため投与に伴う安全性は高く、これまでの実験報告からCO吸入と同様の効果が得られることが示されている）。そこで、CORM投与の有効性を評価する目的で、MHC完全不適合クラウンミニブタC1をドナー、C2をレシピエントとし、脳死誘導・確認6時間後（ドナー臓器摘出直前）に、脂溶性で安全性が高く、国内で入手可能であるCORM-2をドナーに40 mg/kg投与した後、肺移植を行う（n=3）。また、同一ドナーから摘出した腎臓を用いて、併せて腎臓移植も行う（n=3）。免疫抑制療法、移植後の移植臓器機能評価等については、全てH25年度に行った研究に準じて行う。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	脳死ミニブタへのCO投与について検討中である。MHC完全不適合クラウンミニブタという特殊な条件の大動物を使用するため、その入手について困難な状況であった。現在入手した動物においては研究が進んでいる。今年度さらにブタの入手を検討していたが、現在のところ当研究に該当するブタの入手が困難であった。しかし、来年度早々にも入手の目処が立っているため、本年度の予算を次年度に回し、ミニブタの購入に使用するつもりである。本研究に合致したミニブタを購入した後、25年度に行う予定であった腎・肺移植を行う。COの作用機序の評価のため、組織内CO濃度の測定、移植臓器・血液の解析をフローサイトメトリーにて行う。また、グラフト内のサイトカイン等のmRNAをPCRにて評価する。また免疫学的な評価をフローサイトメトリーを用いて評価する予定である。