2013 Fiscal Year Research-status Report

新規分化誘導剤と癌分子標的薬による固形癌細胞の増殖抑制とその分子基盤解析

Research Project

Project/Area Number	25462007
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Research Institute for Clinical Oncology, Saitama Cancer Center
Principal Investigator	粕壁隆埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), その他部局等, 研究員 (50152658)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	癌 / 薬剤反応 / シグナル伝達 / 発生・分化
Research Abstract	我々は、白血病細胞の新規分化誘導剤cotylenin A は単独処理でもある程度乳癌株細胞MCF-7 細胞の増殖を抑制できるが、mTOR 阻害剤で、分化誘導活性もある rapamycin と併用処理すると相乗的に MCF-7細胞の増殖を抑制し、細胞周期のG1期停止を誘導すること、さらに、MCF-7 細胞を移植したヌードマウスに対しても、この併用処理は顕著な治療効果を示すことを見出している。しかし、これら分化誘導剤の併用処理の作用機序は殆ど解明されていない。我々はこれまでにcotylenin A とrapamycin処理によりサイクリンG2遺伝子発現が早期から顕著に誘導されることを見出した。さらに、サイクリンG2に対するsiRNA (small interfering RNA)用いた実験および、サイクリンG2遺伝子の発現が誘導可能なプラスミドを作製した後、MCF-7細胞に導入した実験から、cotylenin Aとrapamycin の併用処理によるMCF-7細胞の増殖抑制効果とサイクリンG2の誘導が密接に関係していることを明らかにした。そこで今年度は、サイクリンG2遺伝子のプロモーター部分をクローニングし、cotylenin A とrapamycinの併用によるサイクリンG2遺伝子発現誘導に必須な領域を検討した。最初に、サイクリンG2遺伝子のプロモーター部分約2kbをクローニングし、さらに、この間を７個に分割したプロモーター部分をサブクローニングした。これらをMCF-7 細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を測定することによって検討した。その結果、-331bpまでのプロモーター部分がcotylenin A とrapamycinの併用によるサイクリンG2遺伝子発現誘導に必須な領域であることを見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 分化誘導剤cotylenin Aとrapamycinの併用による乳癌株細胞MCF-7 細胞の顕著な増殖抑制効果には、サイクリンG2の誘導が密接に関係していることを明らかにしているので、今年度の研究でcotylenin A とrapamycinの併用によるサイクリンG2遺伝子発現誘導に必須な領域を決定したことは、これら併用処理の分子基盤を解明するのにきわめて重要な手がかりを得ることができた。
Strategy for Future Research Activity	cotylenin A とrapamycinの併用によるサイクリンG2遺伝子発現誘導に必須な領域が機能的であるか否かをさらにゲルシフトアッセイを行って検討する。 cDNA microarrayで、サイクリンG2以外で発現の変動が認められた遺伝子の中で、TGFB1 (transforming growth factor, beta-induced, 68kD)、BIK (BCL2-interacting killer)、GRB7 (growth factor receptor-bound 7)、および　EGR3 (early growth response 3)の遺伝子発現もcotylenin A とrapamycinの併用処理で早期に、そして、顕著に変化していた。そこで、これら遺伝子発現と増殖抑制との関連性を解明するために、siRNAを用いて検討する。平成25年度に得られた結果を基にして、また、さらに、遺伝子強制発現実験、ウェスタンブロッティング実験、および、cotylenin A またはrapamycin耐性細胞を用いた実験から得られた結果を詳細に分析し、cotylenin A とrapamycinによる増殖抑制効果の分子的基盤を明らかにし、これらの処理の最も重要な分子標的遺伝子を同定する。