2013 Fiscal Year Research-status Report
ｍｉｃｒｏＲＮＡ-ｇｅｎｅｐａｔｈｗａｙを介した胃癌トラスツズマブ耐性機序の解明
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25462027
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
岩槻 政晃 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 非常勤講師 (50452777)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石本 崇胤 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 助教 (00594889)
渡邊 雅之 公益財団法人 がん研究会, がん研有明病院, 食道担当部長 (80254639)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 胃癌 / Trastuzumab耐性 / microRNA / microRNA array |
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| Research Abstract |
まず、Trastuzumabに対して感受性を示すHER2陽性胃癌細胞株（NCI-N87）を用い、Trastuzumab 100μg/mlを6か月間持続投与を行い、耐性株を作成した。そこで、耐性株と親株でmicroRNA arrayを行い、Trastuzumab耐性に関わると思われるmiRを同定した。これまで、癌関連microRNAと報告されているmiR-21に着目した。
次に、arrayにて同定されたmiR-21とその標的であることが報告されているPTENに注目した。NCI-N87を除くHER2陽性株で、その発現をreal time PCR法・Western blottingで確認し、miR-2１とPTENの発現には逆相関を認め、miR-21高発現/PTEN低発現株とmiR-21低発現/PTEN高発現株を同定した。
また、miR-21の強制発現および発現抑制を行い、PTENの発現・その下流遺伝子であるp-AKT発現の変化を確認した。miR-21の発現抑制を行ったところ、PTEN発現は上昇し、その下流であるp-AKTの発現は低下した。miR-21強制発現を行ったところ、PTEN発現は低下し、p-AKTの発現は上昇した。
miR-21強制発現にてTrastuzumabに対して耐性を示すように変化したが、miR-21の発現を抑制するとTrastuzumabの感受性が増加した。
耐性機序の解明を行うため、miR-21強制発現株にてFACSを用いてアポトーシスの変化について検討したところ、miR-21強制発現株では、Trastuzumab投与下においてアポトーシスの割合が減少していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
耐性株の作成に成功し、microRNA arrayを行うことができ、今後の解析は加速度的に進むことが期待される。しかし、臨床検体の集積が不十分であり、時間を要することが予想される。
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| Strategy for Future Research Activity |
miR-21-PTEN pathwayが胃癌Trastuzumab耐性にアポトーシスを介して関与していることが示され、本研究の妥当性を証明することができた。そこで、本研究で着目するFBXW7遺伝子をregulateするmicroRNAをmicroRNA arrayの結果から、in silicoで現在、検索しており、いくつか候補を同定している(miR Xs)。
miR XsのHER2陽性株化細胞へ強制発現 (pre-miR)、発現抑制 (anti-miR)を行い、FBXW7の発現変化や増殖・浸潤能の変化、トラスツズマブ感受性の変化を確認する。またFBXW7のsiRNAによる発現抑制行い、pre-miRの導入による各種変化がsiRNAと同様であるかを確認する。次いで、耐性の分子生物学的メカニズムの解明をアポトーシスを中心に解析する。
これまでFBXW7の発現低下のメカニズムとして、FBXW7の発現低下がmicroRNAによるものであれば、同定されたmicroRNAが存在する染色体のcopy numberを確認し、genomeレベルでの発現を確認する。FBXW7発現低下がmicroRNAに依存していない場合は、genome copy number loss 、p53 mutation statusや プロモーター領域のhypermethylationを確認し、胃癌におけるFBXW7の発現低下のメカニズムを網羅的に解析する。
In vitroの研究は上記のように、昨年度の結果から進捗が期待できるが、現時点の問題点は、Trastuzumab著効例と耐性例の臨床検体が得られにくいことである。HER2陽性胃癌が15%前後であり、今後も多くの検体は採取できないことが予想される。関連病院への検体採取依頼を行うことで積極的に検体集積をすすめる。しかしながら、集積が困難な場合は、少数例でmicroRNA arrayを行うのは望ましくないため、in vitroで得られたデータのvalidationに用いることで、臨床検体での再現性を確認したい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品等について、比較的安価にて購入、および医局保管のものを使用することができた。
耐性株の作成に成功したことから、今後の解析は加速度的に進むことが期待される。その消耗品購入費、および解析結果や研究関連試料のファイリング・保管等をおこなっていただくための人件費、研究発表のための旅費に充てたいと考える。
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