ヒト骨髄間葉系幹細胞の免疫調節による虚血脳損傷修復機構の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462236
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 大滝 博和 昭和大学, 医学部, 助教 (20349062)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 脳虚血 / 骨髄間葉系幹細胞 / マイクログリア / マイクロアレイ

Research Abstract

当該研究者は、ヒト骨髄間葉系幹細胞（hMSCs）が代替経路型マイクログリア（およびマクロファージ）とのコミュニケーションにより脳損傷を抑制することを見出している。このコミュニケーションは、神経損傷後の神経保護のみならず神経修復・再生に対しても大きく寄与している可能性があるが、その本体は全く不明である。そこで当該年度は脳虚血モデルを用い脳内のマイクログリアの神経保護・再生への役割の解明，hMSCsとマイクログリアの作り出す微小環境どのような因子により制御調節されているかを調べた。hMSCsとマイクログリアのコミュニケーションはマウスマイクログリア培養株BV-2を用いIFN-γによる刺激を行いマイクログリアの活性化をhMSCsが修飾できるかを調べた。さらにマウス一過性前脳虚血モデル動物の脳海馬領域を取り出しそれらのホモジネートをhMSCsの培養培地内に暴露し虚血により誘導されてくる脳内の因子がhMSCsの遺伝子発現を変動させるかをヒト遺伝子マイクロアレイチップを用いて網羅的に探索した。
IFN-γにより刺激されたBV-2はiNOSの発現およびNOの産生を増加したりgp91などの活性酸素産生に関わるタンパク質の発現を誘導するが，hMSCsとの共培養によりそれらの応答は有意に減少した。この抑制は加熱処理や凍結融解により変性させたhMSCsでは再現できずhMSCsがBV-2を修飾することにより起こる応答であることが分かった。さらに，hMSCsは一般的に継代により分化・増殖能を低下することが知られているがBV-2に対する修飾作用はhMSCsは骨・脂肪細胞への分化能を失っても維持され，hMSCsの分化能と異なる制御機構を持つことが示唆された。一方，脳虚血脳ホモジネートを暴露したhMSCsは虚血をしていない脳のホモジネートを暴露したhMSCsと比べケモカインの発現に大きな違いが認められた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当該年度は培養によるマイクログリアとhMSCsの関係およびex vivoによるhMSCsの虚血応答因子の同定および確認をin vivoレベルまでは発展させる予定であったがin vivoの結果が得られなかった。その理由として，本年度より教育に関わるエフォートの増大があり，計画当初に比べ研究にかけるエフォートが取ることができなかったことがある。しかし，本年度の経験により次年度は時間的配分などが明確になったために本年度の遅れを取り戻せるように努める。

Strategy for Future Research Activity

本年度は，hMSCsのマイクログリアに対する修飾作用をIFNγ刺激によるクラシカル型（M1）への活性化させたBV-2により行った。次年度は同様の検討をIL-4による代替経路型（M2）へ活性化させたBV-2により行う。さらに，このM2型のマイクログリアが虚血性細胞死に対しどのような作用を及ぼすか調べるために培養BV-2の虚血脳への移植やBV-2の培養上清を虚血脳に移植することにより確認したい。さらに，マイクロアレイで得られた虚血関連因子により刺激されたhMSCsから産生されるケモカインのタンパク質レベルでの同定をプロテインアレイと免疫細胞染色により決定する。そして，実際それらの応答がhMSCsを虚血脳に移植し経時的に脳内hMSCsを調べることにより決定する。最終的にその因子をsiRNAで欠損させ脳虚血保護作用を調べる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

旅費およびその他経費はほぼ計画通りに遂行できた。しかし，年度末の学内のシステムの更新等の関連もあり物品費に関して報告時点で決算で来ていないものが４０万円ほど残っている。本年度より初めて基金化のシステムで行ったので年度移行時期の対応がうまくできなかった。次年度はこのようなことがない様に年度末に精算したい。
本年度はex vivoシステムを用いヒト骨髄間葉系幹細胞の脳虚血の応答をしらべることができた。次年度は本年度の情報をもとにヒト骨髄間葉系幹細胞が出すどのような因子がマイクログリアの活性化に関与するかまた，そのような因子が脳梗塞の抑制につながるかを具体的に示した行くために動物実験および培養実験ともにsiRNAなどのシステムを用いて解析する。そのための試薬などの整備を行う。さらに学会参加は国際学会の参加を当初２回(国際神経免疫学会，ドイツとRegpep2014, 京都)と考えていたが７月にグリアに関するコールドスプリングハーバーシンポジウム（米国）が開催されることが分かり３回に増やす予定である。その他に関わる論文校正は，現在作成中のものもあり予定通り消化する予定である。本年度の繰越金を含めほぼ予定通り消化できると見込んでいる。

Research Products

• [Journal Article] PACAP38 suppresses cortical damage in mice with traumatic brain injury by enhancing antioxidant activity. (2014)
  • Author(s): Miyamoto K, Tsumuraya T, Ohtaki H, Dohi K, Satoh K, Xu Z, Tanaka S, Murai N, Watanabe J, Sugiyama K, Aruga T, Shioda S
  • Journal Title: J Mol Neurosci Volume: in press Pages: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment and characterization of primary adult microglial culture in mice. (2013)
  • Author(s): Ohtaki H, Tsumuraya T, Song D, Sato A, Ohara K, Miyamoto K, Nakano H, Kiriyama K, Dohi K, Hiraizumi Y, Matsunaga M, Shioda S.
  • Journal Title: Acta Neurochir Suppl. Volume: 118 Pages: 49-54
  • DOI: doi: 10.1007/978-3-7091-1434-6_8.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Therapeutic effects of human mesenchymal stem cells in wistar-kyoto rats with anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. (2013)
  • Author(s): Suzuki T, Iyoda M, Shibata T, Ohtaki H, Matsumoto K, Shindo-Hirai Y, Kuno Y, Wada Y, Yamamoto Y, Kawaguchi M, Shioda S, Akizawa T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 24 Pages: e67475
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0067475. Print 2013.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PACAP Attenuates NMDA-Induced Retinal Damage in Association with Modulation of the Microglia/Macrophage Status into an Acquired Deactivation Subtype. (2013)
  • Author(s): Wada Y, Nakamachi T, Endo K, Seki T, Ohtaki H, Tsuchikawa D, Hori M, Tsuchida M, Yoshikawa A, Matkovits A, Kagami N, Imai N, Fujisaka S, Usui I, Tobe K, Koide R, Takahashi H, Shioda S.
  • Journal Title: J Mol Neurosci Volume: 51 Pages: 493-502
  • DOI: doi: 10.1007/s12031-013-0017-5.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Activation of microglia induces symptoms of Parkinson's disease in wild-type, but not in IL-1 knockout mice. (2013)
  • Author(s): Tanaka S, Ishii A, Ohtaki H, Shioda S, Yoshida T, Numazawa S.
  • Journal Title: J Neuroinflammation. Volume: 10 Pages: 143
  • DOI: doi: 10.1186/1742-2094-10-143.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Low dose of methylmercury (MeHg) exposure induces caspase mediated-apoptosis in cultured neural progenitor cells. (2013)
  • Author(s): Watanabe J, Nakamachi T, Ohtaki H, Naganuma A, Shioda S, Nakajo S.
  • Journal Title: J Toxicol Sci. Volume: 38 Pages: 931-935
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Status of systemic oxidative stress during therapeutic hypothermia in patients with post-cardiac arrest syndrome. (2013)
  • Author(s): Dohi K, Miyamoto K, Fukuda K, Nakamura S, Hayashi M, Ohtaki H, Shioda S, Aruga T.
  • Journal Title: Oxid Med Cell Longev. Volume: 2013 Pages: 562429
  • DOI: doi: 10.1155/2013/562429.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The anti-inflammatory property of human bone marrow-derived mesenchymal stem/stromal cells is preserved in late-passage cultures. (2013)
  • Author(s): Song D, Ohtaki H, Tsumuraya T, Miyamoto K, Shibato J, Rakwal R, Xu Z, Hiraizumi Y, Inoue T, Shioda S.
  • Journal Title: J Neuroimmunol Volume: 263 Pages: 55-63
  • DOI: doi: 10.1016/j.jneuroim.2013.07.018.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Edaravone increases regional cerebral blood flow after traumatic brain injury in mice. (2013)
  • Author(s): Miyamoto K, Ohtaki H, Dohi K, Tsumuraya T, Nakano H, Kiriyama K, Song D, Aruga T, Shioda S.
  • Journal Title: Acta Neurochir Suppl. Volume: 118 Pages: 103-109
  • DOI: doi: 10.1007/978-3-7091-1434-6_18.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Therapeutic time window for edaravone treatment of traumatic brain injury in mice. (2013)
  • Author(s): Miyamoto K, Ohtaki H, Dohi K, Tsumuraya T, Song D, Kiriyama K, Satoh K, Shimizu A, Aruga T, Shioda S.
  • Journal Title: Biomed Res Int. Volume: 2013 Pages: 379206
  • DOI: doi: 10.1155/2013/379206.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Expression and localization of PACAP specific receptor (PAC1R) in bone marrow of mice (2014)
  • Author(s): 徐 枝芳、大滝 博和、渡邊 潤、宮本 和幸、村井謙允、中町 智哉、平泉 裕、沼澤 聡、塩田 清二
  • Organizer: 第35回日本炎症・再生医学会
  • Place of Presentation: 沖縄
  • Year and Date: 20140701-20140704
• [Presentation] Expression and localization of PACAP specific receptor PAC1R in mouse bone marrow (2014)
  • Author(s): 徐 枝芳、大滝 博和、渡邊 潤、宮本 和幸、村井謙允、中町 智哉、平泉 裕、沼澤 聡、塩田 清二
  • Organizer: 第11回GPCR研究会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20140509-20140510
• [Presentation] PACAPの抗酸化誘導作用と加齢性神経変性との関連 (2014)
  • Author(s): 中町智哉，大滝博和，渡邊潤，吉川輝，土田将史，杉山公一，加賀美信幸，今井ノリ，塩田清二
  • Organizer: 第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 栃木・下野
  • Year and Date: 20140327-20140329
• [Presentation] Expression of PACAP/VIP and their receptors in the mouse bone marrow (2014)
  • Author(s): 徐枝芳，大滝博和，中町智哉，渡邊潤，宋丹丹，宮本和幸，平泉裕，沼澤聡，塩田清二
  • Organizer: 第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 栃木・下野
  • Year and Date: 20140327-20140329
• [Presentation] 脳虚血刺激によるヒト骨髄間葉系幹細胞の応答 (2014)
  • Author(s): 大滝博和，谷口紗季，徐枝芳，渡邊潤，宋丹丹，宮本和幸，塩田 清二
  • Organizer: 第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 栃木・下野
  • Year and Date: 20140327-20140329
• [Presentation] 頭部外傷モデルマウスにおけるMRIを用いた神経障害の解析 (2014)
  • Author(s): 渡邊潤，大滝博和，Darwin J Prockop, 塩田清二
  • Organizer: 第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 栃木・下野
  • Year and Date: 20140327-20140329
• [Presentation] マウス頭部外傷におけるPACAPの神経保護作用についての検討 (2014)
  • Author(s): 宮本和幸，大滝博和，土肥謙二，佐藤和恵，宋丹丹，徐枝芳，村井謙充，渡邉潤，田中佐知子，有賀徹，塩田清二
  • Organizer: 第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 栃木・下野
  • Year and Date: 20140327-20140329
• [Presentation] Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells suppressed classical activation of microglial cells (2013)
  • Author(s): Ohtaki H, Song D, Xu Z, Miyamoto K, Shibato J, Rakwal R, Dohi K, Hiraizumi Y, Shioda S
  • Organizer: Neuroscience meeting SFN2013
  • Place of Presentation: San Diego, CA
  • Year and Date: 20131109-20131113
• [Presentation] Effect of water intake on heatstroke of mice. (2013)
  • Author(s): Miyamoto K, Ohtaki H, Miyake Y, Shioda S, Aruga T
  • Organizer: 7th Asian Conference on Emergency Medicine (ACEM)
  • Place of Presentation: Tokyo, Japan
  • Year and Date: 20131023-20131025
• [Presentation] Human stem/progenitor cells from bone marrow improve spinal cord injury via communicating with PACAP. (2013)
  • Author(s): Ohtaki H, Tsumuraya T, Song D, Sato A, Xu Z, Miyamoto K, Hiraizumi Y, Nakamachi T, Hashimoto H, Shintani N, Shioda S
  • Organizer: The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides
  • Place of Presentation: Pecs, Hungary
  • Year and Date: 20130827-20130831
• [Presentation] PACAP stimulates the corneal healing via lacrimal-mediating and direct pathways in mouse. (2013)
  • Author(s): Nakamachi T, Seki T, Wada Y, Ohtaki H, Kagami N, Imai N, Arata S, Hashimoto H, Shintani N, Farkas J, Matkovits A, Reglodi D, Shioda S
  • Organizer: The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides
  • Place of Presentation: Pecs, Hungary
  • Year and Date: 20130827-20130831
• [Presentation] 脊髄損傷マウスにおけるマイクログリア／マクロファージ活性化へのインターロイキン１の関与 (2013)
  • Author(s): 佐藤敦，大滝博和，小原賢司，圓谷智海，平泉裕，渥美敬，塩田清二
  • Organizer: 第86回日本整形外科学会学術総会
  • Place of Presentation: 広島，広島
  • Year and Date: 20130523-20130526
• [Presentation] The anti-inflammatory property of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells is preserved in late-passage cultures.
  • Author(s): Ohtaki H, Song D, Tsumuraya T, Miyamoto K, Shibato J, Rakwal R, Xu Z, Inoue T, Shioda S
  • Organizer: 6th International Symposium on mesenchymal stem/progenitor cells
  • Place of Presentation: College Station, TX
• [Presentation] Localization of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) receptor (PAC1R) in bone marrow of mice
  • Author(s): 徐枝芳，大滝博和，中町智哉，渡邊潤，塩田清二
  • Organizer: 日本解剖学会関東支部第１０１回学術集会
  • Place of Presentation: 東京
• [Book] 最新臨床脳卒中学（上）７月号増刊 (2014)
  • Author(s): 大滝博和，渡邊潤，塩田清二
  • Total Pages: 3
  • Publisher: 日本臨床社
• [Book] Neuroanesthesia and Cerebro-Spinal Protection (Hiroyuki Uchino, Kazuo Ushijima, Yukiko Ikeda eds) (2014)
  • Author(s): Ohtaki H, Shioda S
  • Total Pages: 8
  • Publisher: Springer (Tokyo)