mTOR阻害による寿命延長効果を応用した新規椎間板再生法の確立

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462299
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 三上 靖夫 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80360030)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池田 巧 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40453120) ; 長江 将輝 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60604303)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 椎間板 / mTOR / オートファジー / 抗アポトーシス効果

Research Abstract

本研究では椎間板構成細胞にmTOR阻害剤を投与し、椎間板構成細胞に対するmTOR阻害剤の細胞寿命延長効果を検討し、われわれが確立した自家多血小板血漿とドラッグデリバリーシステムによる椎間板再生法と併用することにより、本再生法の効果持続期間を伸長させ、新規椎間板再生法を開発することを最終目的とする。
生後14～18週の白色家兎から髄核細胞を分離後、単層培養を行い、椎間板髄核細胞の培養系を確立した。細胞が培養皿でsub-confluenceの状態であることを確認後、一定の細胞数で培養皿に継代し、本実験を開始した。培養細胞に対して、mTOR阻害剤であるラパマイシン、オートファジー誘導剤、成長因子を各濃度で添加し、細胞増殖能を定時的に測定した。また、細胞外ストレスを与えた条件のもと、薬剤を投与し細胞増殖能の影響を評価した。薬剤投与による細胞死抑制効果を評価するため、培養細胞に対してアポトーシス誘導後、薬剤を投与し、TUNEL染色陽性細胞数の検討、ウェスタンブロッティングによるカスパーゼ3活性の評価を行った。real-time RT-PCR法を用いて各群の培養液中のaggrecan 、I型コラーゲン、II型コラーゲン、X型コラーゲン、COX-2、Caspase-3などの遺伝子発現量を分析し、薬剤投与による影響を検討した。
生体椎間板内の薬剤徐放化目的のためにゼラチンハイドロゲルの作成を行った。当大学に設置されている7.04T MRIを用いて生体白色家兎の脊椎MRIを行い、今後の白色家兎椎間板撮像のために調整を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

mTOR阻害剤の長期投与により細胞増殖能が低下し、mTOR阻害剤の濃度、処理時間の決定に時間を要しているため。

Strategy for Future Research Activity

ウェスタンブロッティング、real time RT-PCRを用いて薬剤投与による培養椎間板細胞の影響をさらに検討していく。
培養細胞において薬剤投与による変性抑制効果を確認後、生体椎間板における薬剤の徐放化を行う。