細胞形態、糖代謝、微小環境からアプローチする悪性骨軟部腫瘍の転移浸潤制御

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462322
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 柳川 天志 群馬大学, 医学部附属病院, 講師 (40400725)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 細胞形態 / 細胞運動

Outline of Annual Research Achievements

コラーゲンゲルを用いた三次元培養にてヒト線維肉腫細胞HT1080は間葉性遊走をする細胞とアメーバ様遊走をする細胞の両者が混在した状態を呈する。アメーバ様遊走はプロテアーゼ非依存的でプロテアーゼ阻害剤によりHT1080細胞はアメーバ様形態を示す細胞が優位となる。またアメーバ様遊走はRho依存性であるためその下流のROCKの阻害剤Y27632を用いることで間葉性の形態を優位とすることができる。さらに我々がこれまで研究してきた腫瘍の運動能を刺激し転移能を促進する分子autocrine motility factor (AMF)が間葉アメーバ転換(MAT)にどのような影響を与えるかを調べた。
昨年度までの研究では上記の誘導法を用いても100％の細胞に形態変化を引き起こすことはできなかった。他の報告をみても100％の形態変化を明確に示しているものはなかった。そこですべての細胞が形態転換を起こすことにこだわらず上記の刺激でアメーバ様形態、間葉形態の割合をそれぞれ最も優位にすることができる薬剤濃度を調整して実験を進めることとした。
AMF単独ではアメーバ様形態を示す細胞の割合はコントロールに比べ有意差はなかった。またアメーバ様遊走を誘導させた細胞にAMF を添加しても細胞形態に変化はなかった。一方でY27632により間葉性形態を誘導した細胞にAMFを添加するとアメーバ様形態を示す細胞の割合は有意に上昇した。
コラーゲンゲル内の運動能の評価としてコラーゲンゲル上に細胞を含む滴状のコラーゲンゲルを重層し滴状のゲルから移動した細胞の数をカウントした。AMFの添加により細胞運動は有意に上昇したがAMFがアメーバ様形態に変換することが細胞運動の上昇につながるのか、あるいは形態に関わらず細胞運動を促進するのかまでの解析には至らなかった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

研究の協力をしていた大学院生が病気のため実験ができず、その分実験のペースを落とさざるを得なかった。また文献に記されていた通りの設定にしてもアメーバ様形態、間葉系形態を示す細胞の割合が期待していたほど上がらずその検討に時間を要してしまった。

Strategy for Future Research Activity

これまで研究によりAMFは間葉性形態を示している細胞に対し主にRhoAの活性化を強化することによりアメーバ様遊走を刺激することが推察された。AMFの添加により細胞運動は有意に上昇したがAMFがアメーバ様形態変換を促進することが細胞運動の上昇につながるのか、あるいは形態に関わらず細胞運動を促進するのかを確認する。当大学の共同研究施設の顕微鏡を用いてタイムラプス撮影をして細胞のトラッキングを行う。
AMFをプラスミドに組み込み、間葉系形態を示す腫瘍細胞に遺伝子導入すると上皮間葉転換を引き起こすことが知られている。これと同様にAMFの導入により三次元培養下で形態変化が生じるかを調べる。AMFは解糖系にかかわる酵素であることから培養環境からグルコースを減じた環境で形態変化が生じるかも調べる。さらに肉腫の病理検体で間葉系形態を示している部分の割合と糖代謝の亢進との関係も調べる。

Causes of Carryover

研究の協力をしていた大学院生が病気のため実験ができず、その分実験のペースを落とさざるを得なかった。またアメーバ様形態、間葉系形態を示す細胞の割合が期待していたほど上がらずその検討に時間を要してしまったため実験が遅れ予定予算を消化できなかった。またリアルタイムPCRにかかる予算が予定よりも安価で済んだたため予算に少し余裕が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

AMFの添加により細胞運動は有意に上昇したがAMFがアメーバ様形態変換を促進することが細胞運動の上昇につながるのか、あるいは形態に関わらず細胞運動を促進するのかを確認する。当大学の共同研究施設の顕微鏡を用いてタイムラプス撮影をして細胞のトラッキングを行う。
AMFをプラスミドに組み込み、間葉系形態を示す腫瘍細胞に遺伝子導入すると上皮間葉転換を引き起こすことが知られている。これと同様にAMFの導入により三次元培養下で形態変化が生じるかを調べる。AMFは解糖系にかかわる酵素であることから培養環境からグルコースを減じた環境で形態変化が生じるかも調べる。さらに肉腫の病理検体で間葉系形態を示している部分の割合と糖代謝の亢進との関係も調べる。このため予算は細胞観察用のスライド、三次元培養用のゲルなどの購入を中心にする予定である。