骨組織におけるコラーゲン線維形成コア分子の発現機構の解明と再生医療への応用

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462375
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 吉岡 秀克 大分大学, 医学部, 教授 (00222430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松尾 哲孝 大分大学, 医学部, 准教授 (10284788) ; 佐々木 隆子 大分大学, 医学部, 助教 (30133193) ; 矢野 博之 大分大学, 学内共同利用施設等, その他 (50448552) ; 濱中 良志 大分大学, 医学部, 助教 (60274750)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: コラーゲン / 骨 / 細胞外マトリックス / 遺伝子発現調節

Research Abstract

骨組織にはI型、III型、V型、XI型、XII型等のコラーゲン分子が存在する。これらの分子は単独で働くのではなく、複数の分子が高分子会合体（コラーゲン線維）を形成し、機能していることが予想される。現在まで、私たちは骨芽細胞において、V型コラーゲンa1鎖及びa3鎖遺伝子のプロモーター領域に骨芽細胞特異的な転写因子Sp7/osterixが結合し、転写を正に調節していることを明らかにした。本研究においてはV型と共発現するI型コラーゲン遺伝子について、Sp7/osterixの関与について検討した。マウスI型コラーゲンa2鎖遺伝子の近位プロモーターにおいて、Sp7/osterixが結合すると予想される塩基配列が６箇所予想された。そこで各部位を変異させたDNAコンストラクトを作製しルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、骨芽細胞特異的にこの転写因子が結合する部位が１箇所見られた。そこで、この転写因子を過剰発現させると、正常では転写活性やmRNAが増加するのに対し、変異体ではそれらの増加が見られなかった。逆に転写因子に特異的なsiRNAによって、正常では転写活性やmRNAの抑制が見られるのに対し、変異体ではその抑制は見られなかった。さらに骨芽細胞の分化に伴って、I型コラーゲンa2鎖やSp7/osterixの発現が上昇するが、変異体ではその上昇が見られなかった。以上のことより、この部位にSp7/osterixが結合し、骨芽細胞特異的な発現に関与していることが強く示唆された。
コラーゲン由来のペプチドの機能を知る目的で特異的構造（特に酸性或いは塩基性）を示す領域カバーするcDNAを用いて、発現ベクターに組み込んだコンストラクトを準備した。また、miRによる遺伝子の発現調節を調べる目的で、各コラーゲン鎖のmRNAの3’UTR領域のクローニングを始めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

骨に発現しているコラーゲン遺伝子の転写調節に骨芽細胞特異的な因子の関与を明らかにし、コンストラクトの作製も進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

さらにコンストラクトの作製を行い、骨におけるマウスを使った転写調節機構の証明、コラーゲンの各領域の機能の解析、miRの遺伝子発現機構の解析を行い、再生医療への応用を進めていく。