2013 Fiscal Year Research-status Report
敗血症時の肝臓における好中球細胞外トラップ形成と抗凝固薬によるその阻害効果の検討
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25462418
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
下村 泰代 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (80534031)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | DIC / 敗血症 / NETs / リコンビナントトロンボモジュリン / 好中球 / 血小板 |
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| Research Abstract |
方法I）ヒト血液から好中球と血小板をそれぞれ精製し共培養した。NETs形成には、血小板を活性化するPAMPsが必要であるため、PAMPsとしてLPSもしくは血小板活性因子であるトロンビン受容体ペプチド（TRAP）を添加し反応させた。DNAと抗ヒストン抗体,抗MPO抗体で染色し、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。結果I）好中球と血小板の培養ではNETs形成は認めなかった。しかしLPSやTRAPで刺激することで、NETs形成を認めた。
方法II）方法Iに、リコンビナントトロンボモデュリンα(rTMα)、もしくはHeparinを投与して、NETｓ形成を確認した。結果II）LPS+Heparin群では、好中球の細胞形態が破壊され、NETs形成も認められた。一方、LPS+ rTMα群では、好中球の凝集は認めるものの、細胞形態は正常に保たれ、NETｓの形成もLPS群の大量なNETs形成にくらべ、極めて少なかった。
以上のことから、ヒト好中球と血小板の培養によるLPS誘導性のNETs形成は、rTMαで抑制されることがわかった。
方法III）マウス腹腔内にLPSを10mg/kg投与し、72時間後の生存率が約半数となるような敗血症マウスを作成した。このモデルにLPS投与１時間後から、rTMα 6 mg/kg/day (LPS+rTMα群)または生食（LPS+生食群）の腹腔内投与を開始した。結果III）rTMα後投与による72時間後のマウス生存率は、約50%から約100%に向上した。
方法IV）多臓器不全のターゲット臓器である肝臓で、血栓形成の足場となるNETsを確認し、rTMαがその形成を阻害できるのか検討した。健常マウスの肝臓採取と、方法IIIの薬剤投与プロトコールに従ってLPS投与前とLPS投与8、24時間後の肝臓を採取した。これらの肝臓切片を免疫組織染色し、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。結果IV）健常マウスの肝臓ではNETs形成は認めなかった。LPS+生食群において、8、24時間後の肝臓に多数のNETs形成を確認した。一方、LPS +rTMα群の肝臓は、8、24時間後ともNETsの形成はわずかであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究の進行状況は、申請書の平成25年度の計画通りに進んでいる。
研究結果は、平成25年度の日本集中治療学会、日本SHOCK学会、藤田学園医学会、日本麻酔科学会、American Society of Anesthesiologists学会など多くの学会で発表した。日本集中治療学会では教育セミナーの招待講演、日本麻酔科学会では優秀演題を受賞するなど評価されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度の研究の結果が予定通り進行しているのとその結果をふまえ、下記実験を行う。
I）敗血症時の炎症性サイトカインの血中濃度とrTMα投与によるその変化。LPS投与前とLPS投与8、24、36時間後に、それぞれのマウスから心臓採血を施行し、血清中の多種の炎症性・抗炎症性サイトカインの濃度推移を調査する。
この中で変化が認められるサイトカインを見つけ、それらがrTMαの後投与よって変化するのか検討する。
II）敗血症時の致死因子であるHMGB1の肝細胞での産生と血中濃度の検討、並びにrTMα投与によるその変化。LPS投与前とLPS投与8、24、36時間後に、rTMα群とコントロール群それぞれのマウスから心臓採血により血清を採取し、肝臓も採取する。肝細胞を精製し、ウェスタンブロット法でHMGB1の産生状況を確認する。HMGB1の血中濃度はELISA法で解析する。また、rTMα投与によりHMGB1の肝臓内での産生および血中濃度の上昇が抑えられるか確認する。
III）肝臓内免疫応答細胞の動態。LPS投与前とLPS投与8、24時間後にrTMα群とコントロール群のマウスから肝臓を採取し、肝細胞を精製する。各種抗体で染色し、フローサイトメトリーで、肝臓内の好中球、マクロファージ、単球、樹状細胞（DC）、リンパ球などの増加・減少状態を解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当該次年度使用額は、本補助事業期間である平成25～27年度の助成金交付予定額に従って申請した平成25年度科学研究費助成事業交付申請書に準じて、補助事業を誠実に遂行し交付金を適正に使用した結果、生じたものです。
平成26年度以降に使用することによって、より研究が進展することが見込まれます。
当該次年度使用額は、すべて消耗品の購入に用いる。
例）マウス購入費、免疫染色用一次抗体：DNA(DAPI)と抗ヒストン（Histon H2A）抗体,抗MPO(myeloperoxidase)抗体、血小板（抗CD41抗体）、免疫染色用二次抗体、FACS解析用抗体各種、試薬；LPS、PBS、FBSなど。
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[Presentation] “A Novel Role of Recombinant Human Thrombomodulin in the Formation of Neutrophil Extracellular Traps.2013
Author(s)
Yasuyo Shimomura, Mika Suga, Osamu Nishida, Tomoyuki Nakamura, Naohide Kuriyama, Yoshitaka Hara, Yu Kato, Hiroshi Nagasaki, Naoki Yamamoto, Shingo Yamada.
Organizer
2013 Annual Meeting of the American Society of Anesthesiologists
Place of Presentation
San Francisco, USA
Year and Date
20131012-20131016
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