マイクロRNAプロファイリングを基盤とした神経障害・痛みのバイオマーカーの探索

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462435
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 田中 達哉 大阪大学, 医学部, 技術職員 (20645204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中江 文 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 特任准教授(常勤) (60379170)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: マイクロRNA / 神経障害性疼痛モデル

Outline of Annual Research Achievements

本年度は前年度に引き続き、サンプルの分析を行った。以前に取り出し保存していた動物サンプルを用いてSOLID４システムで解析可能な検体を作る試みを再度行ったが、RNAの質を確認する行程で何度かやり直しを行ってもtRNAがmiRNAよりはるかに多く混入する状況が改善されず、度重なる検討を行った。中でもゲルカットの位置や幅を微妙に変更しサイジングを慎重に行うことでtRNAの混入が改善されるかを検討した。しかし回収位置によっては新たにrRNAやSOLIDアダフターの混入が起きることがわかった。またサンプル中のmiRNA以外のコンタミ物質の存在量についての検証をSOLID４システムの分析結果で初めて明らかにするのは非常に効率が悪いため、リアルタイムPCRを用いた簡易的な測定方法を考案しサンプルの品質チェックに利用した。このように様々な検体を作る試みを行ったが状況が改善されなかった。そこで以前SOLID4で分析したデータを改めてIGVゲノムビューワーで双方のマッピングの状態を可視化して確認したところ、本来miRNA（20bp程度）に比べてtRNA(70bp程度)と大きいはずが、分解によってmiRNAと同サイズになっている可能性が確認された。そこでこのままtRNAの分解の原因を追求せずに大規模シークエンサーの分析に移行しても良いかどうかについて、さまざまな経験者から意見をもらい、やはり、別の方法でもう一度はじめからの行程をやりなおすべきであろうという結論に至った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

tRNA大量混入の問題を解決できていないため。

Strategy for Future Research Activity

今後の方針としては、PAGEやBlue Pippinでの回収の方法を試み、それで難しければ精製の行程のプロトコールを変更し、tRNA混入率の低下を目指す。現在より質の良いサンプルが出来ることが明らかになった段階で、新たに分析を開始する予定である。

Causes of Carryover

本年度分析を行おうとしたがtRNAが多量に混入したため分析にふさわしくないと判断しさまざまな試行錯誤でその除去を試みたが成功しなかったため、大規模シークエンサーの行程を行えなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度はPAGEやBlue Pippinでの回収の方法で再度tRNAの混入率低下を目指し、Solid4システムを用いて最終解析を行うための試薬代、情報収集、それら関連の消耗品に拠出予定である。