抗RANKL抗体結合ナノ粒子を用いた前立腺がん骨転移に対する選択的温熱治療の開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462496
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 永田 大介 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (20336689)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河合 憲康 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20254279) ; 郡 健二郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30122047) ; 安藤 亮介 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30381867) ; 惠谷 俊紀 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 臨床研究医 (30600754) ; 戸澤 啓一 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40264733) ; 内木 拓 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (50551272)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 骨転移治療 / 前立腺癌

Research Abstract

方法：N-ビニル-2-ピロリドン/メタクリル酸メチル/メタクリル酸三元共重合体（P(VP-MMA-MA）存在下、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中、鉄ペンタカルボニル（Fe(CO)5）の高温熱分解反応を行うことにより、交番磁場の照射でも発熱する性質を有しているP(V-MMA-MA) 被覆磁性ナノ粒子（P(VP-MMA-MA)-MNP）を合成した。得られたP(VP-MMA-MA)-MNPに標的指向性を付与するため、乳がんや胃がん細胞に認められるHER-2タンパク質のモノクローナル抗体であるハーセプチンとの反応を、CMCDを用いて4℃で20時間行い、ハーセプチン結合P(VP-MMA-MA)-MNPを得た。またがん骨転移の鍵となるRANKL (nuclear factor kappa-B ligand)に着目して抗RANKLモノクロナール抗体との反応も行い抗RANKL抗体結合MNPの作成もおこなった。
結果：In vitroで用いる培養細胞をマウス骨芽細胞培養細胞MC3T3-E1とした。抗RANKL抗体を用いた免疫染色で、MC3T3-E1表面にRANKLが存在することを確認した。100 mmシャーレにMC3T3-E1を1.0×106 cell / Dishで播種し、24時間培養させた。その後1 mg / mLに調整した抗RANKL抗体結合MNPを200 μL添加して、4時間振盪培養を行った。アスピレーターで微粒子を添加した培養培地を吸引除去してPBSで3回洗浄後細胞をはがし、培地4 mLを添加して遠沈管に回収しセルカウントを行った。その後回収した遠沈管を、10,000 rpm, 15 min, 4℃で遠心し、培地を吸引除去した後、12 mol/L塩酸 0.5 mL (6.0×10-3 mol) で取込まれた微粒子と細胞を溶出。鉄濃度測定を行い1細胞あたりに取込まれたマグネタイト量を算出した。マグネタイト量は取り込まれ鉄濃度で換算した。対照として用いた抗HER2抗体結合MNPと抗RANKL抗体結合MNPでは、鉄濃度換算で、それぞれ3.1mg/dl、6.2mg/dlと、抗RANKL抗体結合MNPが有意にMC3T3-E1に取り込まれていたことが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今回の研究の鍵となる抗RANKLモノクローナル抗体結合MNPの作成を行い、正確に癌細胞と結合することを確認できた。

Strategy for Future Research Activity

作成したMNPに関して、さらにin vitroでの評価を繰り返し行い、再現性が確認された後、動物実験へと移行する予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

作成した抗体を用いて、培養細胞を用いた再現実験に時間がかかっている。そのため次年度に使用する試薬の購入費が必要である。
上記の実験で再現性が確認された後、動物実験へと移行し、安全性を実証する。