尿路結石におけるＨＭＧＢ１とＲＡＧＥによる発生機序の解明と阻止機構の証明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462529
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 宮澤 克人 金沢医科大学, 医学部, 教授 (60219772)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森田 展代 金沢医科大学, 医学部, 助教 (20440505)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 尿路結石 / 蓚酸カルシウム / RAGE / HMBG1

Research Abstract

HMGB1およびREGEと尿路結石症発生の関係を明らかとすることを目的として初年度に以下の研究を実施した。ヒト腎尿細管培養細胞（HK-2細胞）とイヌ腎尿細管培養細胞（MDCK細胞）をDulbecco’s modified Eagle’s medium （5% fetal calf serumと1% non-essential amino acidsおよび抗生剤を添加）で継代培養して本研究課題に最適とされるpassage 5～6の状態に調整した。
液体窒素による保存と融解後の培養によって細胞形態と生物学活性に変化が発生しないことを顕微鏡下の観察とMTT assayで検証した。さらに結晶と血清蛋白による反応を最小限とするためserum freeの培養液で24時間培養を行った。そしてこの操作によっても細胞形態と生物学活性に変化が発生しないことを顕微鏡下の観察とMTT assayで同様に検証した。
これら培養細胞からAGPC変法によってTotal RNAを抽出した。また、蓚酸ナトリウム（0.1～1mmol）および蓚酸カルシウム(CaOx)結晶(5～10μg/cm2)を負荷して経時的に回収した細胞から同様にTotal RNAを抽出した。定量PCRに備えてバイオアナライザー(Agilent 2100)にてRNAのqualityとquantityを統一した。
PCRでHMBG1とRAGEならびに尿路結石のケモカインとしてのMCP-1, シグナル物質としてのMAPK遺伝子発現の確認を行っている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

培養細胞の継代段階で培養条件の設定に時間を要した。また、コンタミネーションも生じた。
PCRの段階でprimer至適PCR条件の設定に難渋している。

Strategy for Future Research Activity

継代培養と細胞条件は一定した。
PCRではOn demand primers & probeを使用することで標的遺伝子であるHMGB1とRAGE、MCP-1, MAPK遺伝子発現を定量を施行する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

培養細胞の調整が整わず当初の予定であったPCR、Western blotが施行困難であったため。
培養条件は解決したため初年度計画を次年度に繰り越し施行する