難治性小児固形腫瘍における光線力学的治療に関する基礎的研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462784
• Research Institution: National Research Institute for Child Health and Development
• Principal Investigator: 渡邉 稔彦 独立行政法人国立成育医療研究センター, 臓器運動器病態外科部 外科, その他 (50306734)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 難治性固形腫瘍 / 神経芽腫 / 光線力学的治療

Outline of Annual Research Achievements

～in vitroにおけるALA-PDT～
①NB-1の5-ALAの取り込みとPpIXへの代謝　方法：dishに4.0×105 cellsの細胞を播種し24 hr培養後ALAを添加して最終濃度1.0 mM ALAとし、1, 3, 6, 12, 24 hr作用させた後に細胞を回収しFACSを用いて細胞内に含まれるPpIXの有無を確認した。FACSには励起光に405 nm を用い検出器には695 nmのフィルターを用いた。結果：作用時間依存的に細胞内へPpIXが取り込まれている細胞の数が増加していることが確認された。作用時間48 hrでは細胞内にPpIXを取り込んでいる細胞の数は減少していた。
②NB-1に対するALAの細胞傷害性の検討　方法：細胞は5.0×104 cells/well とし24 hr培養を行った。培養後、0, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000uM ALAで各wellへALAを添加し、4 hr作用させた。作用終了後、PBSを用いて二度洗浄を行い10% WST-8試薬を含むculture mediumを加えて30 min, 37 ℃インキュベートした。インキュベート後、450 nmでの吸光度を測定し生細胞の割合を検討した。結果：作用4 hrにおいて濃度依存的なALA投与による細胞傷害が認められた。
③細胞内外に含まれるPpIXの濃度の検討　方法：細胞外PpIXは培養上清から50uL新鮮培地から50uL取り合計100uLに405 nmの励起光を当て635 nmの波長を計測した。0-20uM PpIXを含む培地から同様に635 nmの波長を計測したものから検量線を作成し各サンプルに含まれるPpIXの濃度を算出した。結果：細胞外PpIXの濃度は作用濃度依存的な増加が確認された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

vitroについては、分析結果が不安定で条件設定を変更して繰り返し行う必要性があった。vivoについては細胞株の生着が確認されたが、vitroの基礎実験が不安定ではvivoへ進むことができなかった。

Strategy for Future Research Activity

本研究の最終年度となる。vitroについては、分析結果が不安定で条件設定を繰り返しようやく安定した結果が得られてきたため、加速度的にアッセイを進められる可能性が出てきた。vivoについては細胞株の生着が得られたものの、vitroの基礎実験に時間を費やしたため、同時進行で行えるように計画していく。定期的なカンファレンスを行い、短期的な結果と計画の見直しを行い、年度中に目標を達成できるよう努力する。