2014 Fiscal Year Research-status Report
歯胚の形態形成におけるＰＰ２Ａインヒビターの細胞内シグナル伝達制御機構の解明
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25462862
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
永田 健吾 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (90189134)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清島 保 九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (20264054)
藤原 弘明 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (50634200)
和田 裕子 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (70380706)
坂井 英隆 九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (80136499) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | I2PP2A / set-alpha / neural crest cell / tooth development |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯の再生医療を見据えた人工的な歯胚再生法の確立を目指した研究を推進しており、既に歯原性幹細胞の作製に着手した。歯原性幹細胞を分化誘導するシステムの確立には、上皮間葉相互作用に重要な歯胚形成因子の分子ネットワークを捉えることが必要である。我々は、マウス歯胚形成初期に強発現を示す遺伝子を検索し、歯胚の形態形成への関与について報告されていない因子をいくつか検出した。I2PP2A(protein phosphatase 2A inhibitor 2/SETα)はそのうちの１つである。
本研究は、歯胚形成過程に重要とされる細胞内シグナリング分子ネットワークであるWnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系に着目し、それらのシグナル伝達を調節しているprotein phosphatase 2Aの阻害因子であるI2PP2Aの制御機構を捉え、その機能的役割を解明しようとするものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成２６年度には胎齢11日マウス下顎および胎齢15日の歯胚組織を用いた器官培養実験を主に行った。いずれの胎齢においても、培養開始から１日毎に３日間I2PP2A siRNAを培地に添加することでノックダウンを行い、実験終了後、通法により組織標本を作製し、形態学的な解析を行った。同時に、タンパクおよびmRNAを回収し歯胚形態形成の変化を機能的に解析するための試料を作製した。I2PP2Aノックダウンにより、I2PP2A mRNAの合成阻害および歯胚形態形成阻害を確認できた、サンプル数を増やしている。また、I2PP2Aシグナリングネットワークを調べる上で、歯原性上皮細胞株を用いて、SmadとAktのシグナリング経路を確認できた。しかし、ProteoTunerシステムを用いたI2PP2Aの発現制御ベクターが作製途中の段階にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) 胎齢11日の下顎および胎齢15日歯胚組織の器官培養を継続して行い、経時的に試料を回収し、歯胚形態形成のシグナル分子ネットワークの解明をめざす。具体的にはI2PP2A を中心として、Wnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系のタンパク質(β-catenin、Smad、MEK、ERK)のリン酸化についてWestern blotting法により解析する。同時に、これらのシグナル伝達系の標的因子であるAxin2、Msx1および歯原性因子(Amelogenin、 Ameloblastin、 Enamelin、Dentin sialophosphoprotein& Dentin matrix protein)のmRNA発現について、リアルタイムPCR法で定量解析を行うともに、歯胚形態形成過程における歯原性因子の発現・分布を時間・空間的に免疫蛍光抗体法にて検索する。
2) ProteoTuner (Clontech社) システムを用いたI2PP2Aの発現制御ベクターを作成する。まず始めに、歯髄細胞株にI2PP2A発現制御ベクターをエレクトロポレーション法により導入し、I2PP2Aの発現制御を行い、Wnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化をWestern blotting法で、シグナル伝達系の標的遺伝子および歯原性因子の定量解析をリアルタイムPCR法で行う。次に、歯原性上皮細胞株でも、同様の実験を行う。
3) 胎齢10日、全胚培養下にて、神経管に近接した神経堤細胞に対してI2PP2A発現制御ベクターをエレクトロポレーション法により導入する。歯胚上皮が肥厚し始める時期まで、３日間培養、その後I2PP2Aの発現制御を行い、Wnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化をWestern blotting法で、シグナル伝達系の標的遺伝子および歯原性因子の定量解析をリアルタイムPCR法で行う。
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