2014 Fiscal Year Research-status Report
侵襲性歯周炎原因菌のキノールペルオキシダーゼの病原性に関する研究
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25462877
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
古西 清司 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (20178289)
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2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ペルオキシダーゼ / 病原因子 / 膜タンパク / 過酸化水素 / 活性酸素 / 阻害剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
侵襲型歯周炎の原因菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitansが産生するキノールペルオキシダーゼ(QPO)は、本菌の過酸化水素耐性や毒素産生に密接に関わっている。QPOは呼吸鎖成分のキノンを基質として利用できることから、呼吸鎖と連結している、あるいは呼吸鎖構成要素のひとつとしても捉えられる。今までの結果より、動力学的な解析からQPOの触媒反応はping pong Bi Bi機構であり、さらにQPOの阻害剤としてascofranone(Ki=9.56 nM), ascochlorine (Ki=24.7 nM), illicicolin B(Ki=566 nM)はそれぞれmixed-type inhibition, competitive inhibition, mixed-type inhibitionであることを示してきた。今回さらにillicicolin F(19.5 nM) が、QPOの強力な阻害剤で、competitive mannerで説明できることを見出した。また、呼吸鎖の阻害剤として広く知られているHQNO(N-heptyl quinoline N-oxide)（0.97 uM)がcompetitive mannerであること、また緑膿菌のクオラムセンシングに関係しているPQS(2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone)(Ki=6.98 uM)もnon-competitive typeの阻害剤であることを見出した。我々はさらにN末端領域1/3(推定キノール結合ドメイン）に存在しているヘムｃの第6配座に関与している可能性が考えられているMetとHisの部位特異的な変異体を作製した。現在それらの大量発現系と精製法を検討中である。またその他の領域（C末端2/3領域、細菌cytochrome c peroxidaseと相同性の高い領域）に関しても、良く保存されているアミノ酸残基の変異株を順次取得しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
QPOの阻害剤として新たにillicicolin FやHQNO、PQSを見出し、その詳細な解析から阻害機構を推定した。これらの成果は複数の学会で報告した。さらに我々は複数の部位特異的変異株を作製することによって、詳細なQPOの酵素反応機構を解明する予定である。野生株の大量発現機構は確立済みであるが、変異株に関しては、そのつど検討が必要で、現在それに多くの時間を費やしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
QPOの大腸菌をもちいたWild typeの組換え酵素の大量発現系は確立済みであり、変異体の作製方法もクイックチェンジ法で速やかに出来ることは確定している。各種変異体の大量発現方法、精製方法について詳細に検討後、精製変異体について、吸収スペクトル、酵素活性、epr,円二色偏光、標準酸化還元電位などの測定を行う。
カイコを用いたA.actinomycetemcomitansの感染実験はすでに報告した。この実験系に関与している病原因子としてleukotoxinが推定できる。そこで現在、本病原因子欠損変異株作製を試みている。またQPOの欠損変異株はleukotoxin分泌を抑えるという知見を得ているので、カイコの系を用いてQPO欠損変異株の病原性、QPO阻害剤の感染カイコへの影響についても検討する。
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