2013 Fiscal Year Research-status Report
CCNファミリ－３の新機能：内軟骨性骨形成における役割
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25462888
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
服部 高子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00228488)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
青山 絵理子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10432650)
滝川 正春 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063)
西田 崇 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (30322233)
久保田 聡 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (90221936)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | NOV/CCN3 / トランスジェニックマウス / 内軟骨性骨形成 / 血管侵入 / Col2a1 promoter |
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| Research Abstract |
１）軟骨組織特異的CCN3過剰発現ベクターの構築とトランスジェニックマウスの作製
軟骨組織特異的CCN3過剰発現ベクター(Col2a1-mNOV-GFP-IRES-LacZ)を作製した。CCN3蛋白はGFPタグとの融合蛋白として発現させたが、蛋白量の不足などで十分なGFPシグナルが得られない場合の外来遺伝子のトレーサーとしてIRES-LacZ遺伝子をmCCN3遺伝子の下流に接続した。作製したCol2a1-mNOV-GFP-IRES-LacZコンストラクトは、マウス受精胚に注入し、トランスジェニックマウスを作製し、２系統のfounder lineを得た。
２）CCN3col2a1tgマウスの骨－軟骨領域における表現系解析
得られたCCN3col2a1tgマウスの表現型を胎生18.5日齢の骨格標本より、肋骨、胸骨の異形成、長管骨の骨化部分の短縮が観察された。そこでマイクロCTにより骨成分の変化を調べたところ、骨化度の低下が認められた。遺伝子発現の変化を調べるために行った胎児期の長管骨の切片標本を用いた軟骨および骨分化マーカー遺伝子のin situ hybridizationから、軟骨の最終分化マーカー遺伝子の発現が遅れている事、また、骨芽細胞マーカー遺伝子陽性細胞の出現も遅延している事が明らかとなった。内軟骨性骨形成過程における軟骨から骨への転換は、軟骨組織への血管の侵入にともなって破骨細胞や骨芽細胞が出現する事が知られているが、CCN3col2a1tg長管骨では、軟骨組織への血管侵入も著しく遅延している事が明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２５年度は、①軟骨組織特異的CCN3過剰発現ベクターの構築とトランスジェニックマウスの作製、②CCN3col2a1tgマウスの骨－軟骨領域における表現系解析を行う事が当初の予定であった。①に関しては、軟骨組織特異的CCN3過剰発現ベクターの構築が完了し、培養軟骨細胞への遺伝子導入によりCCN3の発現が見られる事も確認できた。さらに、このベクターをマウス受精卵に導入し（外部委託）、founder lineの同定（2 lines）、軟骨組織における外来遺伝子の発現も確認できたため、①の計画は完遂できている。さらに②に関しては、CCN3col2a1tgマウスの表現型が同腹マウスで安定しないため、同一founder line由来のCCN3col2a1tg雄雌を交配し、安定した表現型を得た。これまでのところ、骨格標本、組織切片を用いた免疫化学的解析、組織化学的解析、in situ hybridizationによる遺伝子発現解析、マイクロCTによる骨化組織の解析を行っており、当初の計画は十分完遂したものと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（今後の推進方策）
これまでに得られた結果をもとにCCN3col2a1tgの表現型を分子レベルの変化として説明する。これまで既に得られている結果より、CCN3col2a1tgマウスでは内軟骨性骨形成過程に異常がある事は明らかであるが、有意な遺伝子発現の変化が観察されない場合は、Chip遺伝子発現解析、次世代シークエンス解析、代謝産物解析、microRNA網羅解析により遺伝子レベルの変化をとらえる。
また、出生後の軟骨組織におけるCCN3の機能を解析するために、成体CCN3col2a1tgマウスの軟骨組織、特に関節軟骨に注目する。これまでの予備的な観察では、関節軟骨に大きな表現型が生じていることが明らかになりつつある。正常な関節軟骨の機能維持におけるCCN3の役割を分子レベルで解明する事も視野に入れている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度は、使用したマウスの匹数が当初の予定より若干少なくなったため、物品費の使用が少なく次年度使用額が生じた。しかしながら、次年度は予定より多くのマウスを使用する予定で、本年度の剰余額は次年度に使用したい。
上記の理由で、次年度使用額は物品費としての使用を予定している。
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[Journal Article] CCN2 as a Novel Molecule Supporting Energy Metabolism of Chondrocytes2014
Author(s)
Maeda-Uematsu A, Kubota S, Kawaki H, Kawata K, Miyake Y, Hattori T, Nishida T, Moritani N, Lyons KM, Iida S, Takigawa M.
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Journal Title
J Cell Biochem
Volume: 115(5)
Pages: 854-65
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The regenerative effects of CCN2 independent modules on chondrocytes in vitro and osteoarthritis models in vivo.2014
Author(s)
El Kader TA, Kubota S, Nishida T, Hattori T, Aoyama E, Janune D, Hara ES, Ono M, Tabata Y, Kuboki T, Takigawa M.
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Journal Title
Bone
Volume: 59
Pages: 180-8
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Novel chondrogenic and chondroprotective effects of the natural compound harmine.2013
Author(s)
Hara ES, Ono M, Kubota S, Sonoyama W, Oida Y, Hattori T, Nishida T, Furumatsu T, Ozaki T, Takigawa M, Kuboki T.
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Journal Title
Biochimie
Volume: 95(2)
Pages: 374-81
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Roles of CCN2 and CCN3 in skeletogenesis.2013
Author(s)
Masaharu Takigawa, Satoshi Kubota, Takako Hattori, Takashi Nishida, Eriko Aoyama, Nao Tomita, Shinsuke Ito, Danilo Janune, Mitsuhiro Hoshijima.
Organizer
The seventh International Workshop on the CCN Family of Genes
Place of Presentation
Nice, France
Year and Date
20131013-20131016
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[Presentation] Anti-fibrotic role of CCN3 through regulation of CCN family genes2013
Author(s)
Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Janune, D., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Perbal, B., Takigawa, M.
Organizer
The third international symposium of medical-dental-pharmaceutical education and research in Okayama
Place of Presentation
岡山大学50周年記念会館
Year and Date
20130922-20130923
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[Presentation] Crucial role of CCN2 in energy metabolism in chondrocytes.2013
Author(s)
Maeda, A., Kubota, S., Miyake, Y., Kawata, K., Hattori, T., Nishida, T., Moritani, N., Kawaki, H., Lyons, K., Iida, S., Takigawa, M.
Organizer
2nd joint meeting of IBMS-JSBMR
Place of Presentation
Kobe, Japan
Year and Date
20130528-20130601
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[Presentation] Identification and characterization of chondrocytic fibroblast growth factor 1 as a molecular counterpart of CCN family member 2.2013
Author(s)
Abd El Kader, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Furumatsu, T., Kuboki, T., Takigawa, M.
Organizer
2nd joint meeting of IBMS-JSBMR
Place of Presentation
Kobe, Japan
Year and Date
20130528-20130601
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[Presentation] Cartilage-specific overexpression of CCN3 negatively regulates endochondral bone formation.2013
Author(s)
Hattori, T., Ono, M., Hoshijima, M., Kadoya, K., Kuwahara, M., Oie, H., Miyake, Y., Kuboki, T., Takigawa, M.
Organizer
2nd joint meeting of IBMS-JSBMR
Place of Presentation
Kobe, Japan
Year and Date
20130528-20130601
