2013 Fiscal Year Research-status Report
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25462891
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
長谷川 敬展 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (50447273)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 弘 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (90288845)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | アクアポリン5 / 翻訳後修飾 / リン酸化 / ユビキチン化 / 唾液腺 / 細胞内膜輸送 / 細胞内シグナル伝達 |
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| Research Abstract |
水チャネルAQP5が細胞内シグナル依存的にリン酸化および短鎖ユビキチン（Ub）化される事を見出しており、これら翻訳後修飾の単独の役割および修飾間相互作用を調べ、唾液分泌におけるAQP5翻訳後修飾の意義を明らかにすることを目的としている。
短鎖Ub化：これまでの研究では、AQP5短鎖Ub化は微量であることや構成的な細胞内取り込みを受けることが示唆され、その役割を解析することは困難であった。そこで本年度より1～3の新たな複数の手法を導入した。微量な短鎖Ub化による調節的なAQP5の動態を可視化するために、1. ライブセルイメージング法の構築を行い、蛍光標識したタグ付与AQP5を比較的長期間観察できるようにシステムを整えた。AQP5とUbの二分子間相互作用の細胞内局在を検出できる2. Proximity Ligation Assay（PLA）法を採用して、Ub化されたAQP5が主に細胞内に存在することを見出した。また、平成26年度に行う計画であった3. ユビキチンリガーゼE3による強制Ub化実験を開始した。複数種のE3をマウス唾液腺からcDNAクローニングし、AQP5安定発現ヒト唾液腺HSG細胞に強制発現させると、少なくとも2種のE3で、通常のCa2+シグナル惹起時よりもAQP5短鎖Ub化が強く促進された。今後、3. 強制Ub化実験と1. ライブセルイメージングあるいは2. PLA法による解析を複合的に進めることでAQP5Ub化の役割を明確にすることが期待できる。
リン酸化：リン酸化依存的なAQP5結合タンパク質の同定を目的に、培養細胞エピトープタグ発現法を試みた。リン酸化部位を含むタグ付与AQP5C末端ベイトには細胞膜嗜好配列が挿入にも関わらず、主に細胞内に局在するので本法は不適と判断した。現在は同種のタグ融合ベイトとマウス唾液腺抽出物を用いて結合タンパク質解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
AQP5短鎖Ub化：1. AQP5のライブセルイメージング法はほぼ確立しているが、2. PLA法によるUb化AQP5の細胞内局在の解析と同様に、短鎖Ub化がAQP5に与える影響を明らかにするには至っていない。しかしながら、3. 強制Ub化実験でAQP5Ub化を促進するユビキチンリガーゼE3の候補が判明したことで、AQP5短鎖Ub化解析の遂行を加速化する新たな道筋を得ることができ、おおむね順調に進展していると言える。
AQP5リン酸化：本年度はAQP5結合タンパク質の同定を目的とした解析を遂行したが、手法変更に至っている。想定されていたことではあるものの、当初の目的からは遅れていると考えている。
以上の2項目を総合的に判断し、やや遅れているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
AQP5短鎖Ub化については本年度で一定の道筋が得られたことから、今後も複数の手法を複合的に使用しながら解析を進める。AQP5の強制Ub化状況下において、一般的な免疫細胞化学や生化学的手法と共にライブセルイメージング法やPLA法を利用することで、AQP5局在や量を経時的に多角的に調べ、短鎖Ub化がAQP5の細胞内取り込みや分解に寄与するか明確にする。
AQP5リン酸化の解析については遅れていることから、H26年度はより強く推進していくこととする。改善された手法でリン酸化依存的なAQP5結合タンパク質の同定を引き続き行う。さらにリン酸化がAQP5の機能に与えることも想定されるので、主にツメガエル卵細胞やリポソームなどを用いた水透過能解析を当初の予定通り実施し、リン酸化の役割の一端を明らかにする。
また、当初の計画より早期に両翻訳後修飾間の相互作用についての解析を本格的に開始させる。予備実験ではCa2+シグナルでAQP5のUb化のみならず脱リン酸化も促進する結果が得られた。リン酸化とUb化が拮抗しないような細胞内シグナル調節機構が存在する可能性がある。既に作製済みのリン酸化部位AQP5変異体やユビキチン化部位AQP5変異体を利用し、翻訳後修飾間の相互作用に加え、修飾に関わるCa2+およびcAMPの細胞内シグナル間クロストークについても詳細に調べることとしている。
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Research Products
(1 results)
