2013 Fiscal Year Research-status Report
Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞極性化における分子機構の解明
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25462904
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
上原 俊介 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (90434480)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 泰浩 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 准教授 (20264252)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / 骨吸収 / 極性化 / Wnt5a / Ror2 |
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| Research Abstract |
破骨細胞は、極性化することで骨を吸収する。極性化に際して、アクチン骨格の再編成が生じ、これは、アクチンリングという形で観察される。我々は、サイトカインであるWnt5aを欠損した破骨細胞では、アクチンリングが形成されず、骨吸収活性が低下していることを見出していた。さらに、その下流で、低分子量Gタンパク質であるRhoが活性化されること、活性化には、受容体であるRor2が必要であることを見出していた。Rhoに関わるシグナル分子をより詳細に解析するため、平成25年度は、以下の研究を行った。①Wntシグナルの下流でRhoの活性化に関与する分子を探索した。これまでに他の生物では、Dishevelled-associated activator of morphogenesis (Daam)1が関与すると報告されているが、破骨細胞において、Daam1の発現は認められなかった。Daam1と同様にFHドメインを持つタンパク質の遺伝子について、リアルタイムPCRで発現を検討したところ、Daam2が破骨細胞分化に伴って発現してくることを見出した。Daam2に対するshRNAを破骨細胞に導入し、Daam2の発現を阻害したところ、Wnt5a刺激によるRhoの活性化が生じなかった。また、骨吸収活性も低下したが、恒常的活性型Rhoの発現により回復した。②Rhoの下流で働く分子について、既に報告されている13種類のタンパク質の遺伝子の発現をリアルタイムPCRで検討したところ、Protein Kinase N3 (PKN3)の発現が破骨細胞分化に伴い上昇することを見出した。PKN3に対するshRNAを破骨細胞に導入し、PKN3の発現を阻害したところ、骨吸収活性が低下した。この低下は、恒常的活性型Rhoを発現しても回復しなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載した計画に関しては、全て遂行できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画では、ドメイン欠失変異体を発現させることでアクチンリング形成に必要なドメインを同定することを考えていた。しかしながら、同定されたタンパク質であるPKN3のアクチン骨格との関連については、非常に情報が少ない。そこで、PKN3及びアクチンについて、それぞれ蛍光タンパク質と融合したタンパク質を発現するアデノウイルスベクターを作成し、破骨細胞のアクチンリング形成時にPKN3の局在がどのように変化するかをライブイメージングにより明らかにする。また、PKN3の遺伝子欠損マウスの骨及び血清中の骨代謝マーカーについて解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
物品費に関して、実験が想定したよりも順調に遂行されたため、当初予定していたよりも少ない出費で結果を出すことができた。
昨今の細胞生物学系の発表においては、蛍光タンパク質と融合したタンパク質を用いたライブイメージングの手法が重視されている。そこで、我々も、平成25年度の研究により見出したPKN3と緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質、およびアクチンと赤色蛍光タンパク質との融合タンパク質をそれぞれ発現するアデノウイルスベクターを作成し、アクチンリング形成過程におけるPKN3の局在変化をライブイメージングにより明らかにしていきたいと考えている。アデノウイルスベクターの作成およびウイルスの精製に必要となるキットは高額であるが、次年度使用額分を充てることで、実現可能である。
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[Journal Article] Noncanonical Wnt5a enhances Wnt/β-catenin signaling during osteoblastogenesis.2014
Author(s)
Okamoto M, Udagawa N, Uehara S, Maeda K, Yamashita T, Nakamichi Y, Kato H, Saito N, Minami Y, Takahashi N, Kobayashi Y.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 4 4493
Pages: 1-8
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Wnt5a-Ror2 signal regulates osteoclast polarization through Daam2 and Rho
Author(s)
Uehara S, Ishihara A, Maeda K, Yamashita T, Nakamura T, Imai Y, Kato S, Kikuchi A, Nishita M, Minami Y, Udagawa N, Takahashi N, Kobayashi Y
Organizer
国際骨代謝学会(IBMS)・日本骨代謝学会第2回合同学術集会
Place of Presentation
神戸コンベンションセンター（神戸市）
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