2013 Fiscal Year Research-status Report
非典型的なＷｎｔ受容体Ｒｙｋシグナルによる骨代謝制御機構の解明
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25462905
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
中道 裕子 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (20350829)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Wnt / Ryk / 破骨細胞 / 骨芽細胞 |
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| Research Abstract |
Wnt シグナルは多様な生命現象に関与し、その破綻は様々な病態をもたらす。Wnt受容体として7回膜貫通型Frizzledが10種類、1回膜貫通型LRP5, LRP6, Ror1, Ror2およびRykが存在する。Wntは、受容体を使い分けて複雑な生物学的プロセスを精緻に制御し、Rykはその一翼を担う。Wntシグナル伝達様式は古典経路と非古典経路に分類される。古典経路のは骨形成を促進し、非古典経路のWnt5a-Ror2シグナルは、研究協力者の小林らにより、破骨細胞分化を促進することが見出された(Nat Med 18:405, 2012)。一方、Rykシグナルは古典経路と非古典経路の双方に関与し、Rykは異端Wnt受容体と呼ばれる。異端のWntシグナルRykの骨代謝における役割は不明である。Ryk欠損(Ryk KO)マウスは生後1日で死亡するため、Ryk KOマウスを用いた骨代謝機能の解析は不可能であり、申請者が作製したRyk cKOマウスを用いてのみ可能である。これまでにRykは、神経ガイダンスを調節することが示されている（Nature 439:31, 2006)。Rykの生理作用における分子メカニズムは、神経と骨では異なり、状況に応じて多様である可能性がある。本研究は、骨代謝におけるRykの生理作用と分子メカニズムの解明を、国内外において唯一Ryk cKOを用いて行うものである。平成２５年度は、実施計画どおり破骨細胞系列特異的Ryk cKOマウスの作製と解析を完了した。全身的なRyk KOマウスは、生後一日で死亡するが、このマウスにおいては破骨細胞数が減少した。しかし、破骨細胞系列特異的Ryk cKOマウスにおいては、特に骨代謝異常は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書に記した研究実施計画すべての実験を終了し、破骨細胞におけるRykの役割を明確に示すことが出来たため。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請書どおりに骨芽細胞特異的Ryk cKOマウスの解析 を行う予定である。全身的なRyk KOマウスにおける骨形成の低下は、Rykの骨芽細胞系列への直接作用によるのか明らかにする。そのために、Cre-loxPシステムにより、骨芽細胞(Ob)特異的なOsterix発現制御下でRyk遺伝子を欠損させ、Ob-Ryk cKOマウスを作製し、解析を行う。まず、このOb-Ryk cKOマウスにおいて骨芽細胞特異的にRyk発現が抑制されているか、免疫染色により確認する。次に、骨組織形態計測、マイクロCTによる骨密度測定を行う。さらに、Ob-Ryk cKOマウスの骨由来RNAを用いたマイクロアレイ解析を行い、Ryk下流のシグナルカスケードを同定する。さらに、リガンド依存的な(i)Rykのリン酸化、および(ii)Ryk相互作用因子の解析を行う。具体的には、(i)Hisタグ付きRykを骨芽細胞または骨髄細胞に過剰発現させ、Wnt3aまたはWnt5aで刺激する。Cell lysateを用い抗His抗体にてRykタンパクを免疫沈降後、抗リン酸化Ser抗体、抗リン酸化Thr抗体もしくは抗リン酸化Tyr抗体を用いウエスタンブロットを行い、Rykがリン酸化されるか検討する。Rykのリン酸化が認められた場合、様々なRykの欠失変異体を作製し、Rykのリン酸化部位を同定する。(ii) (i)で同定したリン酸化部位の前後のアミノ酸配列についてdata base上でモチーフ検索を行う。その結果を基に、Rykの相互作用因子の候補を絞る。これらの候補因子の抗体を購入し、免疫沈降法により実際に候補因子がRykと相互作用するか、検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
複数の抗体および試薬が、定価より安い金額で購入できたためである。
平成26年度においては、実験が当初の計画通り進んでいるので、平成26年度研究費として計上した額を使用する。しかし、平成25年度の研究実施によりマイクロ解剖道具が破損したため、急遽、新たにマイクロ解剖道具の購入が必要となった。その購入費用にあてる。
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[Journal Article] Noncanonical Wnt5a enhances Wnt/β-catenin signaling during osteoblastogenesis.2014
Author(s)
Okamoto M, Udagawa N, Uehara S, Maeda K, Yamashita T, Nakamichi Y, Kato H, Saito N, Minami Y, Takahashi N, Kobayashi Y.
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Journal Title
Sci Rep
Volume: 4
Pages: 137-146
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Vitamin D receptor in osteoblasts is a negative regulator of bone mass control.2013
Author(s)
Yamamoto Y, Yoshizawa T, Fukuda T, Shirode-Fukuda Y, Yu T, Sekine K, Sato T, Kawano H, Aihara K, Nakamichi Y, Watanabe T, Shindo M, Inoue K, Inoue E, Tsuji N, Hoshino M, Karsenty G, Metzger D, Chambon P, Kato S, Imai Y.
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Journal Title
Endocrinology
Volume: 154
Pages: 1008-1020
DOI
Peer Reviewed
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