口腔扁平上皮がんの浸潤転移、薬剤耐性におけるがん幹細胞ならびに上皮間葉移行の役割

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25462940
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 後藤 満雄 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (60645191)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中西 速夫 愛知県がんセンター(研究所), その他部局等, その他 (20207830)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 口腔扁平上皮がん / 低分化がん / EMT/CSC / podoplanin / TGF-β / PI3K/Akt経路 / 分子標的薬

Outline of Annual Research Achievements

1: 口腔扁平上皮がん(OSCC)株からのがん幹細胞(CSC)形質およびEMT形質を示す亜株の分離
昨年度はCSC様細胞形質を有するUMSCC81B株からverapamil処理の有無によりSP(side population)画分をFACS sortingにより分離し、SP画分からOct4, ALDH, NanogなどのCSCマーカーを高発現しているUMSCC81B-SP亜株を樹立した。本年度は、以前、上記UMSCC81B株からGefitinib処理により線維芽細胞様の形態を示し、E-cadherin発現低下およびVimentin高発現などEMT形質をしめす細胞株(UMSCC81B-Fb)にEGFRを強制発現させることにより上皮分化形質を部分的に回復した細胞株を作製にすることに成功した。

2: CSC/EMTシグナル経路の解析
CSC形質を示す UMSCC81B細胞では下流のMAPK経路とPI3K/Akt/GSK-3β経路が恒常的に活性化されていたが, 本年度はUMSCC81B細胞においてOSCCのがん幹細胞(CSC) マーカーであることが知られているPodoplanin を高発現していることを明らかにした。このPodoplaninをsiRNAでノックダウンしたところ、細胞増殖が有意に抑制されること，逆にE-cadherin発現上昇など分化が促進されることからPodoplanin がCSC 形質の維持に重要な役割を果たして可能性を示唆した。また、PodoplaninがTGF-βによって発現誘導されることも明らかにし、Podoplanin がTGF-β/Smad2シグナル経路の標的である可能性を示唆した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでCSC 形質のひとつとされていたがその機能が不明であったPodoplaninの機能解析を新たに進め、Podoplanin がCSC 形質の維持に重要な役割を果たしていること、またこれにTGF-β/Smad2シグナルが関与することを明らかにするなど、Podoplanin がOSCCのがん幹細胞形質とEMT形質の両者ともに中心的な役割を演じている可能性を明らかにした。また臨床材料におけるPodoplanin発現についても検討し、分化型SCCよりも低分化型SCCで高発現することを見いだし、in vivoにおいてもPodoplaninが未分化状態の維持に関与している可能性を示唆した。以上よりCSC/EMTモデルの作成とその特性解析から、Podoplaninという新たな標的分子を見いだし、また臨床材料を用いた検証実験も行い、OSCCのがん幹細胞形質とEMT形質の解明など本年度の目標を着実に達成している。しかし，一方、Wnt/β-catenin経路については低発現であることもあり機能解析に難渋しており、総合的に達成度は70-80%と自己評価する。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究によりOSCC におけるWnt/β-catenin経路についてはその役割は一部の細胞に限定的であると考えられることから、今後はOSCCのがん幹細胞形質とEMT形質の解析の中心をより重要性（普遍性）の高いPodoplaninに絞って行ってゆく。UMSCC81B細胞株のSP fraction から分離したがん幹細胞形質の強いUMSCC81B-SP細胞とGefitinib耐性から分離したEMT形質の強いUMSCC81B-Fb細胞についてはPodoplaninの解析が不十分であることから、今後これらの細胞を用いてPodoplanin およびTGF-β/Smad2シグナル経路の解析を中心にがん幹細胞形質とEMT形質のちがいにも焦点を当て研究を進めてゆく。またPodoplanin抗体などを用いたOSCCのがん幹細胞を標的とする診断，治療法についても検討してゆく予定である。

Causes of Carryover

当該年度の研究にあたり、研究施設に既存している設備を使用した実験が主であったため、設備備品費の未使用額が発生した。また、消耗品費に関しては、予備実験の必要回数が予想より少なかったことと、Wnt/β-catenin経路の実験が当初予測していた結果が得られなかったために、さらなる解析実験へと進めることができなかったことも未使用額が発生した理由に挙げられる。その他、論文での発表がまだ行われていないこと、海外での研究カンファレンスを当該年度は見送ったことも理由に挙げられる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当該年度に達成できなかった研究、ならびに次年度に計画している研究を、適正に研究費を使用しながら進めて行く。前述のごとくPodoplaninの解析が不十分であることをふまえて、今後Podoplanin およびTGF-β/Smad2シグナル経路の解析を中心に研究を進め、さらにOSCCのがん幹細胞を標的とする診断，治療法についても検討してゆく予定である。それに伴い、次年度は、設備備品、消耗品の購入が増えることが予想されるため、当該年度の未使用額を有効に利用して行く。また、海外での研究成果の発表と研究カンファレンス、ならびに論文作成も予定している。

Research Products

• [Presentation] Biological significance and regulation of podoplanin expression in oral squamous cell carcinomas. (2014)
  • Author(s): Mitsuo Goto, Hiroyuki Makihara, Mitsuhiko Ohta, Shinichiro Maseki, Yasuhisa Hasegawa, Hayao Nakanishi, Kenichi Kurita
  • Organizer: American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons, 96th Annual Meeting, Scientific Sessions & Exhibition
  • Place of Presentation: Honolulu, Hawaii, USA
  • Year and Date: 2014-09-08 – 2014-09-13