2015 Fiscal Year Research-status Report
STD-NMR法による接着性モノマーとコラーゲンとの相互作用の分子レベル解析
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25462951
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
平石 典子 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 日本学術振興会特別研究員 (20567747)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | MDP / 31P 固体NMR / コラーゲン / 象牙質 / 歯科接着性モノマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの溶液NMR測定の結果、リン酸エステル系の代表としてMDP（10-Methacryloyloxydecyl dihydrogen phosphate）を使用し、水溶性のアテロコラーゲンを基質として、疎水結合が働いているものと推測した。しかし、アテロコラーゲンが本来の歯質コラーゲン”線維“とは形態が違うため、不溶性の象牙質コラーゲンを用いて、固体NMRによる測定する実験系に変更の必要を感じた。これは、本来の実験計画にはなかったが、研究目的は歯質コラーゲンとの接着性モノマーの相互作用分析であるので、研究方針を調整することにした。理化学研究所横浜研究所、NMR共用プラットフォームに協力頂き、固体NMR分析方法の条件確認を十分に行った。近年、固体NMRスペクトルの高分解能化が進み、CP/MAS 法により、ウシ象牙質由来コラーゲンに対し、13C核に注目した結果、溶液スペクトルに近いスペクトルが観測可能であった。興味深いことに、ウシ象牙質をEDTA, 酢酸、リン酸で脱灰させた場合、前者2溶液ではコラーゲンの変性は見られないが、リン酸では変性が見られた。固体NMR測定に関して、MDP試料は、より臨床に近い市販のMDP含有歯科接着剤を使用し、反応後、光照射で重合硬化させ、MDPの31P核のスペクトル変化を反応前後で観測した。ウシアキレス腱コラーゲンを基質にし、MDP含有歯科接着剤と反応させた場合、反応時間を60分まで延長させても反応に変化はなかった。これにより、溶液NMR測定で報告した、MDPと水溶性のアテロコラーゲンの疎水結合性相互作用は示唆できなかった。反応性基質として他に、アパタイト粉末、象牙質粉末、エナメル質粉を対象にした。反応時間は1，5，60分とし、それぞれ、MDP中の31P核スペクトルを評価したところ、経時的に反応が起こっていることがスペクトルで確認できた。これら、研究成果は6月のIADR/APR General Session & Exhibition. Seoulに口頭発表予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本来は、STDスペクトルが確認された疎水性MDPモノマーを、アセトン（極性非プロトン性溶媒）、エタノール（極性プロトン性溶媒）にて配合し、リガンド試料とし、アテロコラーゲン溶液で、STDスペクトルへの溶媒の影響を比較検討する予定であった。これに関し、溶液のpH条件を変化させた場合に、アテロコラーゲンの溶解性に変化が現れた為、これまでの分析結果と比較検討できない恐れが出た。さらに、これまでの国際学会、論文により国内外の研究者から意見を頂くことが出来、アテロコラーゲンは、不溶性歯質コラーゲンとは性状が異なる点を示唆され、その改善の必要性に重心を置くことになった。そこで液体NMRに代わり 固体NMR測定CP/MAS 法に切り替え、より臨床に近い不溶性歯質コラーゲンのスペクトラムを得る条件設定を模索した。象牙質脱灰の脱灰方法によるラーゲンのスペクトラムの差を13C CP/MASで、MDPの基質との反応状態は31P CP/MASでスペクトル分析を行った。さらに、象牙質のミネラル分布を確認するため北海道大学 同位体顕微鏡システムにて分析を行った。すでに論文発表されている、ヒト骨由来のコラーゲンのスペクトラムとほぼ一致した為、測定条件が確立できた。MDPの反応を経時的評価するため、反応性基質としては、アパタイト粉末、象牙質粉末、エナメル質粉末、ウシアキレス腱由来タイプIコラーゲンを設定した。またMDP単独ではなく、臨床で使用される市販の光硬化性MDP配合接着剤を、光照射させ硬化し粉砕後、固体NMR試料とした。当初の研究課外内容である液体NMRを変更し、 固体NMR測定にて今後精査を行うことになったが、国内外の研究者からの意見を反映させ、柔軟な対応ができたと考えられる。今年度は固体NMRでの条件設定確認、十分な予備実験も終了しており、継続最終年度に測定し、結果考察に問題なく移行するとこができ、進捗状況は概ね順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
予備実験を元に、更に分析条件の最適化は終了しており、今後の実験系は、固体NMR CP/MAS法によるに分析へ移行する。試料回転速度を極限まで高めることにより、高磁場装置におけるコラーゲン試料での13Cの固体高分解能測定をスペクトルの線形プロフャイルで分析する。固体NMRの試料準備としては、ウシ、ヒト歯質象牙質を粉砕し、脱灰後、コラーゲンを取り出す。予備実験で、ウシ象牙質をEDTA, 酢酸、リン酸で脱灰させた場合、前者2溶液と比較し、リン酸では変性が見られた。 この結果から、欧米で広く使用される、リン酸水溶液で歯面をエッチングした後でボンディングするエッチアンドリンスシステムでは、そのリン酸処理の象牙質コラーゲンへの影響が懸念されると示唆したい。再現実験を行い、リン酸処理による変性コラーゲンが接着界面に残留するエッチアンドリンスシステムの問題点へも言及していく予定である。ウシアキレス腱コラーゲンを基質にし、MDP配合市販の接着剤と反応させた場合、反応に変化観測されず、溶液NMR測定で報告したMDPと水溶性のアテロコラーゲンの疎水結合性相互作用は示唆できなかったが、有機質コラーゲンを含む象牙質で、反応させた場合の、MDP由来31P のスペクトル変化に注視し、MDPのミネラルとの反応、コラーゲンとの反応を再度精査していきたい。過去の国内外の発表は、MDP含有接着性試薬コモノマー（溶液タイプ）を使っており、重合させる前のミネラルとの反応を評価しているが、本研究課題では、MDP配合市販の接着剤を使用することにより、重合後の反応状態、つまりより臨床的視野に基づいた興味深い考察ができると考えられる。他のMDP含有接着性試薬コモノマー（溶液タイプ）発表と比較し、本研究課題の特徴である光硬化後の反応状態は、長期接着性能を評価する上で重要な観点であるため、最終年度、国内外の学術及び論文発表を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
これまでの国際学会、論文に対し、反響をいただき、国内外の研究者から意見を頂くことが出来、アテロコラーゲンは、不溶性歯質コラーゲンとは性状が異なる点を示唆され、液体NMRに代わり 固体NMR測定CP/MAS 法に切り替え、より臨床に近い不溶性歯質コラーゲンのスペクトラムを得る実験系に変更した。、本来の実験計画にはなかったが、研究目的は、概要は歯質コラーゲンとの接着性モノマーの相互作用分析であるので、研究方針を調整することにした。27年度に固体NMR分析方法の条件確認を十分に行ったものの、実際の接着性モノマーと歯質象牙質との反応を測定分析はでは及ばず、次年度で、実験測定を実施することになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
固体NMR測定CP/MAS 法測定に関しては、理化学研究所横浜研究所、NMR共用プラットフォーム 成果非占有利用にて実施する。MDP,ミネラル（ハイドロキシアパタイト）系に関しては、31P核分析の感度が良い為、一回の測定は1時間弱だが、有機質のコラーゲン対象は数時間の積算が必要になり、測定利用時間が長くなると思われる。今年度NMR共用プラットフォーム 成果非占有利用料金は改定中であるが、高額な測定料金になると思われるももの、これまでの予備実験を踏まえ、確実に実行していきたい。また最終年度、国内外の学術及び論文発表を行う予定であり、論文投稿費用、学会旅費に使用したい。
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