三次元培養システムによる歯根膜由来幹細胞とMTA界面の歯根膜再生に関する動態解析

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25462972
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 北島 佳代子 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (00177841)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 五十嵐 勝 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 教授 (90168104) ; 新井 恭子 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 講師 (10434143)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 歯根膜 / MTA / 幹細胞 / 再生 / 三次元培養

Outline of Annual Research Achievements

抜去歯の根面には歯根膜が残存しており、その歯根膜を回収して初代培養を行って得られる細胞の中に極めてわずかな幹細胞様細胞が含まれることが明らかになった。当教室では、歯根膜細胞を幹細胞識別マーカーでラベリングした後、フローサイトメーター（FCM）でソートすることにより高純度の幹細胞様細胞の分取を行っている。今回は、本法を基に分離した幹細胞識別マーカー陽性細胞とMineral trioxide aggregatr(MTA)の接触面における細胞動態と組織構築能を調べることを目的とした。始めにブタやラットの歯根膜からの細胞分取を試みたが、初代培養での派生細胞回収と増殖による必要細胞数の確保が困難であった。そこで今年度は、ヒト抜去歯の歯根膜から採取した歯根膜細胞を初代培養し、増殖した細胞を幹細胞マーカーでラベリングし、FCMにてソートし液体窒素中に保管しておいた細胞を解凍、継代し、実験に供することとした。まず、この細胞を数代継代し、顕微鏡下で観察したところ、互いにコンタクトを取り合うように長く突起を伸ばし、次第に網状の特徴的な細胞集塊を形成することが確認された。蒸留水で混和し円柱状に成形したMTAを、本細胞を含むコラーゲンゲルでコーティングし、底面が多孔質膜とガス透過性膜によりO2とCO2のガス交換可能な培養プレート中に静置し、培養液ならびに分化誘導培地を満たして培養し、顕微鏡下で観察した。MTAと本細胞集塊との共存が確認され、MTA周囲への本細胞突起の伸長が観察された。経時的に回収し、10%中性ホルマリンで固定後パラフィン包埋し、各種染色を施して顕微鏡下で観察したところ、MTA周囲にアリザリンレッド陽性の塊状物が観察された。