自己血液より精製したフィブロネクチンを用いた骨造成法の研究

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25463136
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 真野 隆充 山口大学, 医学部附属病院, 講師 (80325125)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅田 浩嗣 山口大学, 医学部附属病院, 診療助教 (90610618)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: フィブロネクチン / 自己血液 / 骨造成

Research Abstract

本研究の目的は，自己血液より精製したフィブロネクチンを用いた新規の骨造成法を開発することである．in vitro でフィブロネクチンの骨芽細胞の接着，増殖，分化に与える影響を確認し，さらにin vivo で自己血液より精製したフィブロネクチンと人工骨を併用した骨造成法を行った際にフィブロネクチンが骨形成を高める効果を示すかどうかを検証し，自家骨移植を用いない新規の骨造成法の臨床応用を目指す．
1年目の研究として，ラットの血液より精製したフィブロネクチンを塗布した人工骨上で骨芽細胞を培養し，骨芽細胞の接着・増殖・分化に及ぼす影響をin vitro において検討する計画とした．
まずは予備的な実験としてヒト血液を用いて研究を行った．すなわち，10ml カラムに樹脂と樹脂保存液を混和しながら積層する．ゴム栓を装着し，クランプを閉じ，カラムとペリスターポンプを接続し，クエン酸添加リン酸緩衝液（C-PBS）を約10 分間流し平衡化した．ヒト血液を採取し，血漿3ml をカラムに注入し，C-PBS で約10 分間カラム内を洗浄した．その後，L-アルギニン溶出液をカラムに流し，出てきた液をマイクロチューブに採取した．最後にゲル濾過用スピンカラムを用いて溶液中のL-アルギニン溶出液 を取り除き，フィブロネクチンを精製することに成功した．続いて培養実験として骨芽細胞様細胞であるSaos-2を用いて培養したが，細胞増殖が悪く，培養実験ができる状態に至らなかった．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

骨芽細胞様細胞としてSaos-2を培養したが，細胞増殖が悪く，培養実験ができる状態に至らなかった．そこで現在，骨芽細胞としてMC3T3-E1細胞に切り替え，培養増殖させ，培養実験に備えている．

Strategy for Future Research Activity

初年度行えなかった培養実験で，骨芽細胞の増殖の検討およびアルカリフォスファターゼ，オステオポンチン，オステオカルシンmRNAの定量RT-PCRを行う．
これに引き続きラットの自己血液より精製したフィブロネクチンを用いて，ラットの脛骨に骨欠損を作製し，人工骨のみを填入したものとフィブロネクチンと人工骨を填入したものとを組織学的に比較検討を行う．また，骨形成に関与する諸因子の発現を免疫組織化学染色により比較検討する．

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

骨芽細胞様細胞としてSaos-2を用いて培養実験の準備を行っていたが，増殖が悪く，培養実験に持ち込めなかった．従ってその後に予定した骨芽細胞の増殖の検討やRT-PCRを用いたアルカリフォスファターゼ，オステオポンチン，オステオカルシンなどのmRNAの発現の検討ができなかったことから，関連する消耗品の購入を見送ったため未使用額が生じた．
未使用額525,004円については平成26年度の実験に用いる消耗品の購入費と併せて使用する．