2014 Fiscal Year Research-status Report
舌乳頭新生技術確立の為の胎仔培養舌粘膜組織siRNA導入による形態形成干渉の検証
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25463153
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
吉村 建 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (90297953)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 舌粘膜 / 遺伝子導入 / Electropolation / 胎仔 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成25年度においてElectropolation法による遺伝子導入の試行・検証を行ったが、概ね導入効率が高いとは言えない結果であった。そのため引き続き遺伝子導入に際し、さらなる至適条件の探索を行った。妊娠ラットより胎仔を採取し、舌粘膜を周辺組織とともに分離し、NEPA GENE社製遺伝子導入装置NEPA21の各種設定パラメータを変え、pCAGGS-eGFPベクターの導入を行った。導入後、Opti-MEM血清低減培地によりCO2インキューベータ（5％ CO2、95％ 大気）にて器官培養を行い、導入後24、48、72時間後に447nm UV-LEDイルミネータ照明下で515nmロングパスフィルター装着実体顕微鏡にてGFPの組織内蛍光を観察した後、導入72時間後に4％PFA固定ならびに凍結切片を作製し、抗GFP抗体（MBL社製）による免疫染色を行い、実体顕微鏡像とともに導入効率の比較検討を行った。その結果、導入後72時間で舌組織内に比較的良好なGFPの蛍光と、それに対応した免疫染色像を得られる至適パラメータを得ることができた。得られた結果に関し、第56回歯科基礎医学会大会においてポスター発表を行った。
同時に、導入72時間後の舌粘膜組織を直ちに4％PFAにて固定し結切片を作製ののち、本学先端研究センター現有のZeiss社製LSM710 共焦点レーザー顕微鏡にてOptical Sectioning法によるGFPの蛍光の観察を行った。その結果、免疫染色像に近い蛍光像を観察する事ができた。これらの結果によりsiRNAの共導入への見通しが立った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Electropolation法による遺伝子導入において、さらなる至適条件の探索が必要だったため。
NEPA21は、他社製の遺伝子導入装置ではできないような多岐に渡る導入パルスの設定も可能であるが、反面設定できるパラメータが多く、調整幅も非常に広いため至適条件を得るのに時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回の試行で比較的良好な導入条件を得ることができた。次年度はsiRNAとの共導入を行い、導入後の組織において各種抗体による蛍光免疫染色を行い、GFPやsiRNAの蛍光範囲における形態形成因子の挙動を本学先端研究センター現有のZeiss社製LSM710 共焦点レーザー顕微鏡にてOptical Sectioning法により形態学的に観察する予定である。
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| Causes of Carryover |
Electropolation法による遺伝子導入において、さらなる至適条件の探索が必要だったため、予定していたターゲットsiRNA遺伝子との共導入ができなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
比較的良好な導入パラメータ・条件を得ることができたので、本使用額を用い、siRNAの合成を外部業者に委託することで、siRNA遺伝子との共導入を行う。
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