2013 Fiscal Year Research-status Report
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25463183
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
木内 奈央 徳島大学, 大学病院, 助教 (30457329)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 栄二 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (40273693)
川合 暢彦 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (40437588)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | RNAi / 骨格筋 / リポソーム |
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| Research Abstract |
まず最適濃度のリポソームを検討するため、20～25週齢のC57BL/6野生型マウスを用い、左側咬筋にコントロールとして生理食塩水を、右側同部位に様々な条件のリポソームを局所投与した。その結果、カチオン性脂質であるDC-6-14、中性脂質であるCholesterol、DOPE、POPCがin vivoにおけるsiRNA導入に至適な2:3:3:2のモル比で調製されたものが組織傷害が少なく、本研究で用いることとした。siRNAは、Mstに特異的なMst-siRNAと、ネガティブコントロールであるscrambled siRNA（scr-siRNA）を使用した。
そこで、野生型マウスの左側咬筋にMst-siRNAとカチオン性リポソームの複合体（Mst-siRNA-lipoplex）を局所導入した。同一個体の右側咬筋にはscr-siRNAとカチオン性リポソームを導入し対照側として用いた。局所投与して3日後にマウス咬筋を採取し、生化学的・組織学的解析を行った。組織学的解析として、採取した対照側あるいはMst-siRNA導入側、各咬筋について切片を作製しHE染色を行った。このHE染色像から筋線維直径および断面積の計測とその分布様相を解析した。生化学的解析として、遺伝子発現に対するRNAiによる為害性の有無を検討するため、Mst発現レベルをリアルタイムPCRシステムにて解析した。その結果、Mst-siRNA-lipoplex投与側咬筋は、顕著なMstの発現抑制とともに組織学的に筋線維の増大を伴った骨格筋量の増加を認めた。また、筋分化関連遺伝子myoD、myogeninの発現レベルが上昇し、骨格筋形成が促進されていることが示唆された。
現在、筋ジストロフィーモデルマウスであるmdxマウスを用いて、野生型マウスと同様に、各siRNAを局所投与し、その効果を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
咬筋の組織学的解析を行いながら筋組織傷害が生じない最適濃度なリポソームの条件を検討するのに予定より多くの時間を費やしてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
筋ジストロフィーモデルマウス（mdx mouse）を用い、リポソームを併用したMst-siRNA導入がマウス骨格筋量および筋機能に与える影響を検討する。
合成二本鎖siRNA（scr-siRNA およびMst-siRNAとしてMst-siRNA）をリポソームと混合して左右のマウス咬筋および脛骨筋にそれぞれ局所投与する。また全身応用として眼窩下静脈叢よりこれらの複合体を投与する。
組織学的解析として、siRNAの局所あるいは全身導入から１週間および２週間経過時に、マウス咬筋および脛骨筋を採取し、上皿自動天秤を用いて骨格筋重量を測定する。また、対照群（scr-siRNA導入群）あるいはMst-siRNA導入群、それぞれの筋について切片を作製しHE染色を行い、筋線維直径および断面積の計測とその分布様相を解析する。生化学的解析として、マイオスタチン遺伝子に対するRNAiによる筋分化への影響を検討するため、採取したマウス組織よりtotal RNAを抽出し筋分化マーカーであるMyoDファミリーに属する遺伝子（MyoD, myogenin）の発現レベルをリアルタイムPCRシステムにて解析する。
さらに筋機能回復度の検討として、siRNAの局所あるいは全身導入から２週間後、マウス脛骨筋を腱と頸骨ごと採取し、脛骨筋の重量、テンションを加えた時の伸展量、電気刺激を与えた時の振れ幅をもとに筋張力（specific force）を算出する。また、その他の筋機能回復度の検討として筋ジスモデルマウスの背部にテレメトリーシステムを埋め込むとともに送信機につながった記録用針電極を咬筋、大腿四頭筋に刺入して1週間の記録（control data）をとった後、siRNAの局所投与を実施し約３週間終日筋電図を測定して筋機能の回復度を検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
最適濃度なリポソームの条件を検討するのに予定より多くの時間を費やし、当初予定していたin vivoにおける実施が遅れたため、マウスの購入や筋機能解析で必要となる物品費等を使用する機会が少なかった。
筋ジストロフィーモデルマウス（mdx mouse）を用い、リポソームを併用したMst-siRNA局所および全身導入がマウス骨格筋量および筋機能に与える影響を検討する。
筋ジスモデルマウスの購入、HE染色などの組織学的解析やリアルタイムRCRによる生化学的解析で使用する抗体、さらに筋機能回復度の検討として筋張力（specific force）試験やテレメトリーシステムにて使用する物品等を購入する予定である。
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