歯の萌出経路形成における歯槽骨骨吸収メカニズムの解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25463194
• Research Institution: Kyushu Dental College
• Principal Investigator: 森川 和政 九州歯科大学, 歯学部, 助教 (70514686)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 牧 憲司 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (60209400)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 破骨細胞 / IP3R / ポドゾーム / インテグリン / 接着複合体 / ゼストスポンギンC / Adenophostin A

Outline of Annual Research Achievements

本研究計画は、歯の萌出経路形成に関わる破骨細胞でのIP3R-Ⅲ型の役割の解明およびIP3R-Ⅲ型の細胞接着との関わりを解明するために、以前より行っているIP3Rアンタゴニストおよびアゴニストを破骨細胞に作用させる実験をさらにすすめ、IP3RアンタゴニストであるゼストスポンギンCおよびアゴニストであるAdenophostin A を作用させた破骨細胞におけるインテグリンの細胞内ドメインに形成される接着複合体を構成するSrcやCas、Pyk2とIP3R-Ⅲ型との局在について in vitroおよび in vivoで明らかにする予定である。さらにIP3R-Ⅲ型が破骨細胞の形質膜に発現することをタンパク、遺伝子レベルで解析し、細胞接着部位であるポドゾームとの関連を解明する予定である。
ラット破骨細胞を用いて、以前の研究でRT-PCR法による破骨細胞における遺伝子発現と免疫蛍光染色法による局在について研究を行なったが、今年度は、破骨細胞全体における発現ではなく、破骨細胞の細胞接着部位であるポドゾームが局在する形質膜のみでのIP3R-Ⅲ型の発現を解明する予定であった。
〈実験１〉遺伝子解析(RT-PCR法)：破骨細胞の形質膜のRNAを抽出し、IP3R-Ⅲ型の遺伝子発現の定量を行った。
〈実験２〉膜不透過性ビオチン化試薬を用いた形質膜タンパクの分離による解析：ラット骨髄細胞より破骨細胞を形成し、膜不透過性ビオチン化試薬であるSulfo-NHS-Biotinylation Kit(PIERCE)を用いて選択的に外側表面をビオチン化して形質膜タンパクを分離し、IP3R-Ⅲ型に特異的な抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロッティング法によって分析を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、歯の萌出経路形成において重要な働きを持つ破骨細胞でのIP3Rの役割を免疫組織学、生化学的にさらに解明し、歯槽骨の骨吸収による歯の萌出に関わるメカニズムを明らかにすることを目的としている。
現在までのところ、歯の萌出時の破骨細胞におけるIP3Rアンタゴニストを用いた実験、および歯の萌出時の破骨細胞におけるIP3Rアゴニストを用いた実験に関して、歯の萌出経路形成に関わる破骨細胞においてのインテグリンの細胞内ドメインに形成される接着複合体を構成するSrcやCas、Pyk2とIP3R-Ⅲ型との局在に関する解析は進んでいるが、今年度に予定していた「膜不透過性ビオチン化試薬を用いた形質膜タンパクの分離による解析：ラット骨髄細胞より破骨細胞を形成し、膜不透過性ビオチン化試薬であるSulfo-NHS-Biotinylation Kit(PIERCE)を用いて選択的に外側表面をビオチン化して形質膜タンパクを分離し、IP3R-Ⅲ型に特異的な抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロッティング法によって分析する。」に関する解析・解明が遅れているため。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度は平成28年度からの研究を進める一方で、破骨細胞の細胞骨格画分による解析：ラット骨髄細胞から破骨細胞を形成した後、detergent-soluble fraction(細胞質)とdetergent-insoluble fraction(細胞骨格)に画分して、IP3R-Ⅲ型に特異的な抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロッティング法によって分析する予定としている。