歯周病原菌による歯肉上皮でのエピジェネティクス機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25463223
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 西村 学子 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (10337040)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 太田 亨 北海道医療大学, 個体差健康科学研究所, 教授 (10223835) ; 荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (40306254) ; 古市 保志 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (80305143) ; 安彦 善裕 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (90260819)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / 歯周病 / 歯肉線維芽細胞 / 歯肉上皮 / 歯周組織 / 歯周病原菌

Outline of Annual Research Achievements

エピジェネティクスは、後天的には主に環境因子により遺伝子の表現系が変化する現象である。歯周炎に関わる環境因子としての多くは、口腔内で長時間にわたり歯周病原菌に曝されている環境下にあり、これがエピジェネティクス修飾を誘発し、歯周病の発症・進行に関与している可能性がある。そこで、P.gingivalis由来LPSを、ヒト歯肉由来線維芽細胞に長期間作用させた際のエピジェネティクス変化について研究を行った。LPSは半持続的に培養液に添加、ヒト歯肉由来線維芽細胞に長期刺激(1~４ヶ月間)を与え、DNAメチレーションアレイにより解析したところ、fibronectin type III（FN）とαI(XII)collagen(XII-collagen)の プロモータ領域のCpG islandにDNA高メチル化領域が見出された。さらに、両遺伝子のメチル化特異的PCRである定量的MSP法においてもDNA高メチル化が確認された。また、両遺伝子の高メチル化とmRNA発現の相違については、RT-PCRの結果からXII-collagenとFNの有意なmRNA発現減少を認め、XII-collagenやFNのmRNA発現変化にはエピジェネティックな変化、特にDNAメチル化が関与していることがうかがえた。さらに本年度は、XII-collagenやFN以外の細胞外基質タンパク(ECM)関連の７遺伝子のmRNA発現においてもDNA高メチル化が起こっており、ECM関連遺伝子が歯肉線維芽細胞のエピジェネティクスに強く影響していることが考られた。このECM関連遺伝子とDNAメチル化の関連性についてさらにタンパク質レベルで解析をCELISA法で確認したがXII-collagenとFNの発現解析で、有意な発現減少が認められたことから、機能的にも歯周組織由来細胞にエピジェネティクスな修飾を及ぼしていると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究室や所属機関内での時間的な制約が増加してきており、十分な実験研究への遂行時間をとるのが困難な環境ながら、少しづつ結果を積み上げているところである。３年目は歯周病原菌が及ぼすエピジェネティックな影響、特に歯周組織と細胞外マトリックスタンパク(ECM)関連遺伝子と関連性について検索することができ、進行状況が遅いながらも歯周病進行に関連した遺伝子の検索と機能変化について研究を行うことができている。最終年度も引き続き研究遂行する予定である。

Strategy for Future Research Activity

歯周病原菌(LPS)感染による歯周組織のエピジェネティクス機構解析のため、DNAメチル化プロフィール解析により歯周病に関わる遺伝子のタンパク質発現レベルについて機能的な解析を行ってきたが、歯周組織由来細胞に影響を与えている現象なのかどうか、引き続き、本疾患関連遺伝子について検討したい。現在のところXII-collagenとFNのmRNAとタンパク発現からDNAの高メチル化が歯周病の進展に影響してることを示唆するデータと、他にも７つのECM関連遺伝子の関連についての結果を得ているが、今後はこの遺伝子の機能的な検索とこれ以外の主要遺伝子についても、エピジェネティクス修飾に影響している遺伝子について検討したい。また、ヒストンのプロフィール解析も行い歯周病関連のターゲット因子について検索し、歯周病進展に関係するエピジェネティクスを解析する。

Causes of Carryover

歯周病のエピジェネティクスに関する因子の遺伝子結果は明らかになっていているが、その機能検索についてや再現性についての検索がまだ不十分である。また他のエピジェネティクスとしてのアセチル化解析についての検索も遅れている状況である。以上の内容についての研究結果を追求するための経費と時間が必要となる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

エピジェネティクスの解析を引き続き行う（MSP法）、定量的real-time PCR、タンパク発現解析（ELISA法、各種抗体など）
ヒストン修飾の解析（Chip-クロマチン免疫沈降法、タンパク抽出とタンパク発現実験に伴う試薬類）

Research Products

• [Journal Article] DNA hypermethylation of extracellular matrix-related genes in human periodontal fibroblasts induced by stimulation for a prolonged period with lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis. (2016)
  • Author(s): Takai R, Uehara O, Harada F, Utsunomiya M, Chujo T, Yoshida K, Sato J, Nishimura M, Chiba I, Abiko Y.
  • Journal Title: J Periodontal Res. Volume: 51 Pages: 508-517
  • DOI: doi: 10.1111/jre.12330.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Osseous choristoma of the tongue: two case reports. (2016)
  • Author(s): Bhoj Raj Adhikari, Jun Sato, Tetsuro Morikawa, June Obara-Itoh, Masafumi Utsunomiya, Fumiya Harada, Takatoshi Chujo, Rie Takai, Koki Yoshida, Michiko Nishimura, Mamata Shakya, Hiroki Nagayasu, Yoshihiro Abiko.
  • Journal Title: J.Medical Case Reports. Volume: 10 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1186/s13256-016-0840-8.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Porphyromonas gingivalis由来Lipopolysaccharide長期刺激によるヒト歯根膜線維芽細胞における老化遺抑制伝子のDNAメチル化解析．高井理衣、原田文也、森川哲郎、Bhoj Raj Adhikari、伊藤-小原純、中條貴俊、宇津宮雅史、植原 治、吉田光希、佐藤 惇、西村学子、千葉逸朗、安彦善裕． (2015)
  • Author(s): 高井理衣、原田文也、森川哲郎、Bhoj Raj Adhikari、伊藤-小原純、中條貴俊、宇津宮雅史、植原 治、吉田光希、佐藤 惇、西村学子、千葉逸朗、安彦善裕．
  • Journal Title: 北海道医療大学雑誌 Volume: 34 Pages: 17-22
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] エピジェネティクス修飾変化によるマラッセ上皮様細胞の脱分化． (2016)
  • Author(s): 森川哲郎、吉田光希、Bhoj Raj Adhikari, 小原-伊藤 純、原田文也、宇津宮雅史、中條貴俊、高井理衣、植原 治、佐藤 惇、倉重圭史、西村学子、齊藤正人、千葉逸朗、安彦善裕．
  • Organizer: 第34回北海道医療大学歯学会・学術大会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2016-03-05 – 2016-03-05
• [Presentation] DNA hypermethylation of Klotho gene by LPS derived from p.gingivalis. (2015)
  • Author(s): R. TAKAI, F. HARADA, M. UTSUNOMIYA, T. CHUJO, O. UEHARA, K. YOSHIDA, J. SATO, M. NISHIMURA, I. CHIBA, Y. ABIKO.
  • Organizer: The 63rd Annual Meeting of Japanese Association for Dental Research
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2015-10-30 – 2015-10-31
• [Presentation] 口腔扁平苔癬における上皮接着関連遺伝子、p16およびMGMTのDNAメチル化解析． (2015)
  • Author(s): 條貴俊、Bhoj Raj Adhikari、原田文也、宇津宮雅史、高井理衣、吉田光希、佐藤 惇、西村学子、橋本和彦、井上孝、安彦善裕．
  • Organizer: 第24回日本口腔内科学会総会・学術大会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2015-09-18 – 2015-09-19
• [Presentation] LPS長期刺激による細胞外マトリックスのDNAメチル化解析． (2015)
  • Author(s): 高井理衣、植原 治、原田文也、宇津宮雅史、中條貴俊、吉田光希、佐藤 惇、西村学子、千葉逸朗、安彦善裕．
  • Organizer: 第57回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • Place of Presentation: 新潟
  • Year and Date: 2015-09-11 – 2015-09-13
• [Presentation] P.gingivalis由来LPS長期刺激による歯根膜線維芽細胞における細胞外基質タンパク関連遺伝子の高メチル化． (2015)
  • Author(s): 高井理衣、原田文也、宇津宮雅史、中條貴俊、植原 治、吉田光希、佐藤 惇、西村学子、千葉逸朗、安彦善裕．
  • Organizer: 第26回日本臨床口腔病理学会学総会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2015-07-29 – 2015-07-31
• [Presentation] 口腔扁平苔癬におけるDNAメチル化解析． (2015)
  • Author(s): 中條貴俊、Bhoj Raj Adhikar、原田文也、宇津宮雅史、高井理衣、吉田光希、西村学子、橋本和彦、井上 孝、安彦善裕．
  • Organizer: 第26回日本臨床口腔病理学会学総会
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2015-07-29 – 2015-07-31
• [Presentation] LPS長期刺激によるヒト歯肉線維芽細胞でのfibronectin とXII-collagenのDNAメチル化について． (2015)
  • Author(s): 西村学子、高井理衣、植原 治、原田文也、宇津宮雅史、中條貴俊、吉田光希、佐藤 惇、安彦善裕．
  • Organizer: 第104回日本病理学会学総会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2015-04-30 – 2015-05-02
• [Presentation] LPS長期刺激による老化遺伝子のDNAメチル化解析． (2015)
  • Author(s): 高井理衣、原田文也、宇津宮雅史、中條貴俊、植原 治、吉田光希、佐藤 惇、西村学子、千葉逸朗、安彦善裕．
  • Organizer: 第104回日本病理学会学総会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2015-04-30 – 2015-05-02