2013 Fiscal Year Research-status Report
重度歯周病原細菌のnon-coding RNA検索とその動態
| Project/Area Number |
25463230
|
|---|
| Research Institution | Nihon University |
|---|
Principal Investigator |
平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (80246917)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 細菌 / 核酸 / 遺伝子 / non-coding RNA / 病原性 / 歯周病 |
|---|
| Research Abstract |
本研究は，重篤な歯周病と最も関連性のあるred complex３菌種に、侵襲性歯周炎の原因細菌の１つであるAggregatibacter actinomycetemcomitansを加えた４菌種のnon-coding small RNAsを最新の次世代シークエンサーを用いて網羅的に同定・解析し、in silicoで予測されているnon-coding RNAを検証するとともに、新規のnon-coding RNAを発見するし，病原因子関連遺伝子の新たな転写調節メカニズムの解明と，歯周病診断に有用な診断マーカーとなり得るプローブを見出すことを目的とする。
平成25年度は，Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola およびA. actinomycetemcomitansの４菌種について，次世代シークエンサーにかける試料作成を行った。各菌種をそれぞれ適当な培地にて培養し，hemin 制限，酸化ストレス，温度ストレス，pH ストレスをかけ，経時的にサンプルを抽出した。Trizol/column法（Invitrogen）にてtotal RNA を精製し，Nanodrop（分光光度計）を用いた濃度測定とAgilent 2100 Bioanalyzer を用いた濃度・RNA の品質管理をおこない精製した試料のRNA の分解が進んでいないことを確かめた。ここから 23Sと16SrRNAを除去し, さらに5S rRNA および tRNA が含まれる100bp以下のサイズを除去することで，mRNAとnon-coding RNA rich サンプルを作成した。作成したサンプルは，Agilent 2100 Bioanalyzer を用いてrRNA やtRNA の除去が充分であることを確認した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は次世代シークエンサーにかける細菌の試料作成であり、計画に従い重篤な歯周病と最も関連性のあるred complex３菌種（Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola ）に、侵襲性歯周炎の原因細菌の１つであるAggregatibacter actinomycetemcomitansを加えた４菌種について，各種ストレスを加えた後RNAを抽出，mRNA-richな試料に精製することで，次世代シークエンサーにかける試料作成を行った。
|
| Strategy for Future Research Activity |
イルミナ社 TruSeq RNA Sample Prep Kit を用いて，RNA 断片化，逆転写反応，2nd 鎖 cDNA 合成，および末端修復（3’A 付加）を行い，サンプル識別用インデックスタグを含むアダプターライゲーションを行う。PCR 増幅を施した後，AMPureXP ビーズによる精製・低分子除去（約150bp）を行い, 次世代シークエンス用ライブラリーを調整し，次世代シークエンサーによる塩基配列の解読および解析を行う。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
旅費として計上していた分が早期割引で安価になったため。また、別の学会では大学で使用できる公費を使ったため。
次年度において計上される費用の大部分が次世代シークエンサーの使用にかかるため、学会出張費の一部として使用する計画である。
|
