2014 Fiscal Year Research-status Report
Ｔｏｌｌ様受容体とケモカインに着目した歯槽骨代謝機構の解明
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25463232
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
中村 公也 北海道大学, 大学病院, 助教 (00261313)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
出山 義昭 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (80271667) [Withdrawn]
兼平 孝 北海道大学, 大学病院, 講師 (90194935)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 辺縁性歯周炎 / 骨芽細胞 / Toll-like receptor 5 / CX3CL1 / CCL2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ケモカインは白血球遊走・活性化作用を有するサイトカインであり，歯周疾患の発症・進行に関与しているものと推測されている。本研究の目的は，歯周疾患の発生・進行に関与する細菌の一種であるTreponema denticolaが有するToll-like receptor 5 リガンドであるFlagellinに着目し，それが誘導する種々のケモカインと骨芽細胞様MC3T3-E1( E1 )細胞との関連を明らかにすることである。
昨年度の研究により， FlagellinがE1細胞においてCX3CL1の遺伝子誘導をもたらすことが示された。そこで，本年度は，まずそのタンパク発現についてELISA法を用いて研究を進めたが，その遺伝子発現から推測される状況とは異なる結果がもたらされた。そこで，その原因となっているものが何であるかをCX3CL1 mRNAの発現動態も含めて現在，検討しているところである。
また，これまでの研究でFlagellinはE1細胞においてケモカインの一つであるCCL2を誘導することが明らかになっていたので，これに関する研究も並行して行った。FlagellinはE1細胞においてOPG mRNAの発現を抑制すること，およびCCL2の中和抗体を添加するとその抑制がさらに亢進されることがこれまでに示されていたので，今回はMCP-1によりE1細胞を刺激してOPG mRNAの発現についてreal time PCR法にて確認した。その結果，その発現は処理後3時間をピークに誘導されることが明らかになり，これまでの研究結果を裏付けるものとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定では，CX3CL1の発現誘導に関して，情報伝達系の解析等を行う予定であったが，研究実績の概要で記載した通り，タンパク発現について予測した通りの結果が得られなかったたため，遺伝子発現についてもその結果が再現性のあるものかも含めて検討中であり，やや実験計画に遅れが生じている。ただし，CX3CL1 mRNAのFlagellinによる誘導自体は確認されているので，次年度以降ではすでに骨芽細胞の刺激を行っているCCL2とあわせてCX3CL1を用いた実験も遂行できるものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度はCCL2に関しては，MC3T3-E1細胞におけるOPG mRNAの発現が誘導されることは確認できたので，RANKLの発現に対して影響を及ぼすか否かをreal-time PCR法あるいはELISA法にて確認する。さらに，CX3CL1に関して，その発現動態がTNF-α，IFN-γ等の炎症性サイトカイン＋Flagellinで刺激することにより変化がみられるかをreal-time PCR法等を用いて確認する。また，これまでに行う予定であったCX3CL1の発現誘導に関するメカニズムについてNF-κB，MAP kinase等に着目し，確認する予定である。
また，Flagellin，CCL2，CX3CL1でE1細胞を長期間刺激し，石灰化が出現するか否かを検討する予定である。
最終的には上述した研究結果をまとめ，CCL2，CX3CL1が骨代謝をめぐるサイトカインネットワークにおいていかに作用するのかを解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
CX3CL1タンパクの発現状況が予測されたものと異なり，その確認に時間を費やしたために専用kitを用いて実施する予定であった情報伝達系に関する実験等を行うことが出来ず，それに伴い物品費が最初の想定より少額であったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は今年度実施することが出来なかった情報伝達系に関する実験についてNF-κB，MAP kinase等に着目し，その発現動態を確認する予定である。この実験で使用する専用kitの購入に充当する予定である。
また、当初は考慮していなかったCCL2をMC3T3-E1細胞に作用させてRANKL，OPGの発現について検討することにしたが，それに用いるELISA kitにも充当する予定である。
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