2013 Fiscal Year Research-status Report

胆石症における脂質トランスポーターのトラフィッキング異常機構のin vivo解析

Research Project

Project/Area Number	25504008
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	University of Shizuoka
Principal Investigator	山崎泰広静岡県立大学, 薬学部, 助教 (80415330)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	コレステロール胆石症 / コレステロールトランスポーター / Abcg5 / Abcg8 / ABC transporter / 細胞内トラフィッキング
Research Abstract	食の欧米化（高カロリー食中心の食生活）による過栄養状態は、生体のコレステロール恒常性を乱すことにより、動脈硬化症、脳血管疾患、心臓病、胆石症等の重篤な疾患を引き起こす。特にコレステロールの体外への主要な排泄経路である肝臓から胆管への胆汁排泄、およびそれを担うABCG5/ABCG8コレステロールトランスポーターの発現・機能変化は、これら疾患発症のメカニズムを解明するうえで極めて重要である。本研究は、申請者らが構築した新規in vivo動態解析法を用いて、ABCG5/ABCG8の過栄養状態における細胞内トラフィキングへの影響とコレステロール胆石症発症との関係について解明することが目的である。 2013年度は、Abcg5-CFP/Abcg8-YFPをマウス肝臓に発現させ、その分布変動の経時変化を解析した。その結果、これらトランスポーターが粗面小胞体でヘテロダイマーを形成し、ゴルジ体から基底膜を経由することなく毛細胆管膜に到達するという移行経路が新たに解明された。また毛細胆管膜に到達する前に、一度エンドソーム画分に含まれる何らかの小胞に蓄えられる可能性が示唆された。さらに胆石症誘発食飼育マウスでは、これらトランスポーターの毛細胆管膜への到達が速くなること、また遺伝子導入18～24時間後では普通食群に比べて毛細胆管での発現が増加し、エンドソーム画分での発現は減少していることを見出した。以上の結果から、肝臓に異常蓄積したコレステロールを排泄するために、ABCG5/ABCG8の毛細胆管膜への移行が促進されるという翻訳後調節が存在することが明らかになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2013年度は実験計画の初年度であるため、in vivo動態解析系の最適化、およびABCG5/ABCG8の詳細な細胞内トラフィキングの解明に時間をかけた。その結果として、粗面小胞体でヘテロ二量体を形成し、ゴルジ体を出た後一度細胞内に存在する小胞を経由してから毛細胆管膜に到達するという新たな移行経路が明らかとなった。また、胆石症誘発食飼育マウス肝臓では、これらトランスポーターの毛細胆管膜への移行が促進されることが明らかとなった。本成果は、食事や栄養状態の変化が肝トランスポーターの細胞内トラフィッキングに影響を及ぼすことを実験的に証明した初めての知見であり、コレステロール胆石症発症メカニズムを解明するために非常に重要な知見が得られたと考えている。一方で、ABCG5/ABCG8の小胞輸送を制御する新規分子と翻訳後修飾の同定に関しては、進展を得ることはできなかった。しかし、Abcg5-FLAG発現プラスミドDNAを新たに構築し、マウス肝臓にAbcg5-FLAGおよびAbcg8-YFPを同時に発現させること、および遺伝子産物を抗FLAG抗体を用いて免疫沈降により単離することに成功しており、次年度に向けた研究基盤を整えることができた。
Strategy for Future Research Activity	平成25年度に胆石症誘発食負荷がABCG5/ABCG8の毛細胆管膜への移行を促進させることがわかったので、26年度以降は、過栄養状態により誘導されるABCG5/ABCG8の膜局在化に関与する翻訳後修飾、およびその修飾機構について解明する。具体的にはABCG5-FLAG/ABCG8-YFPをハイドロダイナミック法により高脂肪食負荷マウス肝臓に発現させる。摘出した肝臓から肝毛細胆管膜画分、エンドソーム画分をショ糖密度勾配遠心方により調製し、抗FLAG抗体でそれぞれ免疫沈降する。沈降物をphos-tag電気泳動で分離し、リン酸化の有無について検討する。トランスポーター分子のリン酸化が確認されたら、抗リン酸化セリン、スレオニン、チロシン抗体を用いてABCG5/ABCG8のリン酸化部位をスクリーニングする。同様に、抗ユビキチン化抗体を用いて、ABCG5/ABCG8のユビキチン化の状態を調べる。さらに、免疫沈降物の質量分析を行い、他の翻訳後修飾や会合タンパク質を同定する。候補となる翻訳後修飾が同定されたなら、修飾部位のアミノ酸を別のアミノ酸に置換した変異ABCG5-FLAG/ABCG8-YFP発現遺伝子を構築し、ハイドロダイナミック法により普通食飼育マウスに導入する。その後、in vivo動態解析法によりトラフィキングへの影響を調べる。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	電気泳動用の発色試薬、および感光フィルムを節約したため。電気泳動用の発色試薬、および感光フィルムが残り少ないので、その購入費に充てる。