植物の重力の大きさに応答した遺伝子発現の制御機構に関する研究

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25514001
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 小竹 敬久 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (20334146)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 曽我 康一 大阪市立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00336760)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 重力応答 / シロイヌナズナ / アラビノガラクタン-プロテイン / MAP65

Research Abstract

重力の大きさに応答して遺伝子発現が変化する遺伝子として、特にシロイヌナズナのMAP65遺伝子とアラビノガラクタン－プロテイン（AGP）遺伝子に着目した。これらはいずれも過去の研究で、遠心過重力条件下で遺伝子発現が低下することが分かっている。本年度は、これら２つの遺伝子のゲノミック遺伝子にGFP遺伝子を連結した人工遺伝子をシロイヌナズナに導入することで、簡便に遺伝子発現量や遺伝子産物を観察、定量することを目指した。また、これら遺伝子のプロモーター領域の段階的に切り詰めることで、重力の大きさに応答した遺伝子発現に関与するプロモーター領域を大まかに特定することを目指した。
MAP65遺伝子についてはおよそ2 kbのプロモーター領域をもつゲノミック遺伝子を単離し、プロモーター領域を５段階で切り詰めたMAP65-GFP遺伝子コンストラクトを作成した。また、これら人工遺伝子を導入した5種類のMAP65-GFPシロイヌナズナを作成した。AGP遺伝子については、およそ2.6 kbのプロモーター領域をもつゲノミック遺伝子を単離し、プロモーター領域を６段階で切り詰めたAGP-GFP遺伝子コンストラクトを作成した。これらのうち、シロイヌナズナに導入できたものは、全長のものと1.5 kbを切り詰めた２つである。全長のMAP65-GFPシロイヌナズナ及び全長のAGP-GFPPシロイヌナズナの蛍光シグナルを共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、いずれも明瞭な蛍光シグナルが確認できた。一方、組換え植物のラインによる差も大きく、重力の大きさによる変化を正確に解析するには、蛍光シグナルが強いホモラインを確立する必要がある。また、組換え植物の作成がやや遅れてたため、プロモーター領域の特定は次年度に行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

２つの重力応答遺伝子のゲノミック遺伝子の単離やこれらのプロモーター領域を段階的に切り詰めた遺伝子コンストラクトの作成および、これら人工遺伝子のシロイヌナズナへの導入を行ったが、AGP遺伝子についてはまだ人工遺伝子の導入が完了していない。また植物の観察は、２つの遺伝子ともプロモーターが全長のものしか完了していない。これは、ゲノミックPCRやコンストラクトの作成や配列の確認に時間がかかってしまったためである。また、十分なライン数が得られなかったAGP-GFP導入シロイヌナズナがあり、形質転換を繰り返し行った（現在も行っている）ことも進捗がやや遅れた原因の一つである。しかしながら、最も時間がかかると考えられる作業は完了しつつあり、今後は比較的スムーズに実験を進めることができると考えている。

Strategy for Future Research Activity

５段階でプロモーター領域を切り詰めたMAP65-GFP遺伝子の導入植物と５段階でプロモーター領域を切り詰めたAGP-GFPの導入植物すべてについて、蛍光シグナルが明瞭なホモラインを確立する。その後、これらMAP65-GFP遺伝子導入植物とAGP-GFP導入植物について、遠心過重力条件下で蛍光シグナルの変化をを調べる。これに併せて、GFP抗体を用いたウェスタンブロッティングと定量的RT-PCRも実施し、重力の大きさに応答した遺伝子発現変化に関与するプロモーター領域を絞り込む予定である。これらの実験に向けて、（i）卓上遠心機を利用した遠心過重力環境の作出、（ii）MAP65-GFPとAGP-GFPのウェスタンブロッティングによる検出、（iii）定量的RT-PCRによるmRNA量の定量について予備実験を行っており、いずれも問題なく実施できる見込みである。
プロモーター領域が絞り込まれた後は、まず、配列データベースから、特定の転写因子が結合する配列モチーフの有無を検索する。過重力条件下での遺伝子発現について網羅的にデータを収集し、同様の発現変化を起こす遺伝子のプロモーター領域に類似のモチーフがないかを調べる。これらの情報をベースとして、重力の大きさによる遺伝子発現の変化に必要なシスエレメントを特定する。また、国際宇宙ステーションでの実験・観察に利用可能な遺伝子発現変化を可視化したシロイヌナズナの作出もめざす。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

プロモーター領域を５段階（MAP65遺伝子）または６段階（AGP遺伝子）で切り詰めた遺伝子コンストラクトの作成とこれらのシロイヌナズナへの導入が遅れてしまったため、本来25年度に行う予定であった、これらの植物のGFP観察を26年度に行う必要が生じたため。
26年度に繰り越した323,410円のうち、150,000円は、MAP65とAGPの遺伝子発現解析（消耗品）に使用する予定である。50,000円は顕微鏡観察に必要な器具等（消耗品）に、残りの123,410円はシロイヌナズナの育成に充てる予定である。

Research Products

• [Journal Article] beta-Galactosyl Yariv reagent binds to the beta-1,3-galactan of arabinogalactan-proteins. (2013)
  • Author(s): Kitazawa K., Tryfona T., Yoshimi Y., Hayashi Y., Kawauchi S., Antonov L., Tanaka H., Takahashi T., Kaneko S., Dupree P., Tsumuraya Y. and Kotake T.
  • Journal Title: Plant Physiology Volume: 161 Pages: 1117-1126
  • DOI: 10.1104/pp.112.211722
  • Peer Reviewed